生物活性肽PA1b分布及作用機(jī)理研究.pdf

1、PA1b（豌豆白蛋白1b）是一37 個(gè)氨基酸單鏈多功能的生物活性肽，于1986 年首次從豌豆種子中分離與鑒定，其第3、7、15、20、22、和32 位點(diǎn)的氨基酸殘基為半胱氨酸。它廣泛分布于豆科植物中，是一種熱穩(wěn)定性，抗胃蛋白酶、胰蛋白酶水解的生物活性肽。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的主要功能有：1）昆蟲毒劑，可殺滅谷類象鼻蟲，對人和環(huán)境沒有危害；2）在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)愈傷組織的生長和促進(jìn)細(xì)胞分裂；3） 具有調(diào)節(jié)血糖的作用，當(dāng)注射劑量為5μg/g

2、體重時(shí)，PA1b 能顯著提高正常昆明小白鼠和II 型糖尿病模型鼠的血漿葡萄糖濃度。當(dāng)注射劑量為2.5μg/g 體重時(shí)能明顯降低I 型、II 型糖尿病模型鼠的血漿葡萄糖濃度。 有關(guān)三級結(jié)構(gòu)研究顯示它屬于一種半胱氨酸結(jié)的肽類，被命名為cyclotides，有這種結(jié)構(gòu)的肽因?yàn)榫哂袧撛诘目股睾涂拱澆〉奶匦远鴤涫荜P(guān)注。 該肽在植物體內(nèi)參與生長和代謝的調(diào)節(jié)，其作用模式與動物體內(nèi)胰島素和胰島素樣生長因子作用類似。它在大豆種子中可結(jié)

3、合7S Bg 蛋白，7S Bg 蛋白又可以結(jié)合動物胰島素和胰島素樣生長因子。故PA1b 又名為Leginsulin，Leginsulin 有催化7S Bg 蛋白磷酸化的作用。 為了進(jìn)一步研究PA1b 分布與功能，及其可能與動物胰島素系統(tǒng)之間存在的某種關(guān)系，我們制備了抗PA1b 的單克隆抗體及多克隆抗體，作為對該肽深入研究的重要工具。從豌豆種子中經(jīng)純化鑒定得到PA1b 后，采用戊二醛二步法將PA1b 連結(jié)在載體蛋白牛甲狀腺球蛋白（

4、BTG）上，用該連結(jié)物作為免疫原。用碳二亞胺作交連劑，將PA1b 連結(jié)在載體蛋白人血清白蛋白（HAS）上，用此連結(jié)物作檢測抗原。 通過皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c 小鼠、免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合、經(jīng)ELISA 方法對陽性克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選、并用有限稀釋法對分泌抗PA1b 抗體的陽性細(xì)胞進(jìn)行多次克隆，得到5 株能穩(wěn)定分泌抗PA1b 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為H9、F6、E5、C7 及A10。通過小鼠腹腔注射陽性細(xì)

5、胞擴(kuò)大培養(yǎng)、采集腹水和用辛酸－硫酸胺對腹水進(jìn)行純化得到了較純的單克隆抗體。并對抗體的亞類（亞型）、效價(jià)、特異性和親和力進(jìn)行了分析，它們屬于IgG1 和IgG2b 亞類，輕鏈均為κ鏈，有較好的特異性和較高的親和力。同時(shí)通過免疫新西蘭大白兔、收集血清并進(jìn)行純化獲得了較好的多克隆抗體。 應(yīng)用以上制備的抗體，建立了一種檢測PA1b 的竟?fàn)幰种艵LISA 方法，這種方法有比用放射性物質(zhì)標(biāo)記的放射免疫分析法的優(yōu)越性，它是通過酶標(biāo)記二抗來對抗

6、原進(jìn)行定量分析。在這種方法中，對抗原的結(jié)構(gòu)沒有任何破壞。通過一系列已知濃度的PA1b 作標(biāo)準(zhǔn)，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，它檢測PA1b 的最小檢測極限為15nmol/L，線型范圍在15nmol/L~730nmol/L 之間。為了評價(jià)這種ELISA，通過比較批內(nèi)與批間檢測到的PA1b 量，對批內(nèi)與批間的差異進(jìn)行了分析，這種方法平均批內(nèi)差異為2.81％，批間差異為6.74％，回收率分別是在97.44~103.84％和94.87~102.72％之間。

7、 用上述方法檢測了PA1b 在多種植物和小鼠的組織中的分布，發(fā)現(xiàn)PA1b 不但在多中植物中分布，而且在小鼠的某些組織中也存在，這個(gè)結(jié)果被免疫組織化學(xué)、免疫印跡所進(jìn)一步證實(shí)，這是首次證實(shí)PA1b 跨界存在，開拓了對這一重要多肽激素研究的新領(lǐng)域。另外也發(fā)現(xiàn)了在豌豆種子發(fā)芽中PA1b 含量的變化規(guī)律。 為了研究PA1b 對血糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理，用表面等離子共振生物傳感器、原子力顯微鏡等技術(shù)，對動物組織中是否存在與PA1b 相互作用

8、蛋白進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在動物胰腺組織的細(xì)胞膜上有與PA1b 相互作用的蛋白。并采用親和層析的方法從豬胰腺細(xì)胞膜上純化得到了該蛋白。用ELISA 實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)蛋白能夠與PA1b 結(jié)合。通過SDS-PAGE 分離、膠內(nèi)胰酶水解、MALDI-TOF-MASS 鑒定后獲得這個(gè)蛋白的肽指紋圖譜。依據(jù)肽指紋圖譜在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.matrixscience.com)中用Mascot Search 匹配比較，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)電壓