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文檔簡介
1、目的: 增殖誘導(dǎo)配體(aproliferation-inducingligand,APRIL)屬腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)超家族成員之一,在正常組織中表達很弱,其主要功能為調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖和體液免疫反應(yīng)。但近年發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細胞和腫瘤組織中卻有高水平表達,并且異位表達的APRIL具有促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、促進血管內(nèi)皮細胞生長和誘導(dǎo)新生血管生成等作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此深
2、入研究APRIL分子的作用機制及其抑制劑的篩選,可為APRIL高表達相關(guān)的多種腫瘤治療提供新型候選制劑和藥物設(shè)計的新靶標。本課題組多年來研究中藥單體、生物制劑和化療藥對腫瘤細胞的免疫修飾作用,并且在誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡方面取得一定成果。在此基礎(chǔ)上,本研究將中藥單體淫羊藿苷(icarrin,ICA)、黃芩苷(baicali,BAI)聯(lián)合化療藥物多柔比星(doxorubicin,又稱ADM)作用于人肝癌HepG2細胞,采用MTT、RT-P
3、CR以及免疫組化等方法從細胞、分子、基因水平探討這些藥物抑制HepG2細胞中APRIL以及bcl-2、VEGF的表達,進而抑制腫瘤細胞增殖、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞免疫逃逸和抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用及機制,為這些中藥單體聯(lián)合化療藥的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法: 1.MTT法檢測25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM以及12.5μg/mlICA+1μg/mlADM、100μg/mlBAI+1μg/m
4、lADM5個藥物處理組與未用藥對照組HepG2細胞的增殖活性;CD3AK細胞對5個用藥處理組和未用藥對照組HepG2細胞的殺傷活性;5組藥物作用后的HepG2細胞培養(yǎng)上清與未用藥處理的HepG2細胞培養(yǎng)上清相比,對血管內(nèi)皮細胞ECV304增殖的影響。 2.RT-PCR法檢測APRIL及其受體HSPG在HepG2細胞中的表達情況;經(jīng)5組藥物處理后HepG2細胞APRIL以及凋亡相關(guān)基因bcl-2表達水平的變化;經(jīng)CD3AK作用后,
5、HepG2細胞中bcl-2表達水平的變化;APRIL的相應(yīng)受體HSPG在ECV304細胞中的表達情況。 3.免疫組化檢測經(jīng)5組藥物處理后,與未用藥對照組相比,HepG2細胞中血管內(nèi)皮細胞生長因子VEGF表達水平的變化。 結(jié)果: 1.不同質(zhì)量濃度的ICA、BAI以及ADM作用48h后,對HepG2細胞具有增殖抑制作用,其中ICA25μg/ml,BAI400、200、100μg/ml,ADM16、8、4、2μg/ml
6、組與未用藥對照組(0μg/ml)相比,增殖抑制作用明顯(P<0.01)。 2.25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM、12.5μg/mlICA+1μg/mlADM以及100μg/mlBAI+1μg/mlADM5個用藥處理組與未用藥對照組(0μg/ml)相比,對HepG2細胞具有明顯的增殖抑制作用,且ICA、ADM、ICA+ADM、BAI+ADM組的增殖抑制作用呈明顯的時間依賴性,96h抑制率最高,抑制率
7、分別為(29.30±6.62)%、(63.60±1.35)%、(99.03±0.10)%、(98.89±0.18)%(均為P<0.05)。 3.APRILmRNA及其受體HSPGmRNA在HepG2細胞呈高水平表達。 4.5個用藥處理組HepG2細胞APRIL基因mRNA與未用藥對照組相比,表達減少,相對定量值由對照組的0.71分別降至0.69、0.68、0.47、0.43、0.42。 5.5個用藥處理組HepG
8、2細胞bcl-2基因mRNA與未用藥對照組相比,表達減少,相對定量值由對照組的0.98分別降至0.77、0.79、0.81、0.70、0.69。 6.CD3AK對5個用藥處理組的HepG2細胞在效靶比為12.5:1時,24h殺傷率分別為(97.23±5.11)%、(93.12±9.88)%、(60.45±5.71)%、(43.87±8.2)%、(47.25±2.68)%明顯高于對照組的(30.00±4.50)%(均為P<0.01
9、)。 7.CD3AK與5個用藥處理組的HepG2細胞作用后,HepG2細胞bcl-2mRNA表達相對定量值,對照組由0.98降至0.85,5個用藥組由對照組的0.85分別降至0.65、0.74、0.51、0.65、0.61,與CD3AK作用前相比,HepG2細胞bcl-2mRNA的相對表達值進一步明顯下降。 8.免疫組化結(jié)果顯示,與未用藥對照組相比,HepG2細胞經(jīng)5個用藥組處理后,VEGF的表達明顯下降。 9.
10、HepG2細胞經(jīng)5個用藥組處理48h后,另加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)48h的上清與未用藥處理的對照組上清相比,對ECV304細胞具有明顯的增殖抑制作用,抑制率分別為(2.79±5.57)%、(15.20±3.79)%、(12.10±4.50)%、(19.34±8.17)%、(20.27±4.77)%(均為P<0.05)。 10.APRIL受體HSPGmRNA在ECV304細胞中呈高表達。 結(jié)論: 1.APRIL及其受體HS
11、PG在HepG2細胞中呈高水平表達,APRIL可能是以自分泌形式作用于自身受體HSPG發(fā)揮其促腫瘤細胞增殖的活性。 2.ICA、BAI聯(lián)合ADM在降低APRILmRNA和凋亡相關(guān)基因bcl-2mRNA表達水平的同時,顯著抑制HepG2細胞增殖活性,表明其下調(diào)APRIL、bcl-2mRNA表達水平可能是其抑制腫瘤細胞增殖的相關(guān)機制。 3.ICA、BAI聯(lián)合ADM處理后的HepG2細胞,對CD3AK細胞的殺傷敏感性增強,逆轉(zhuǎn)
12、腫瘤細胞的免疫逃逸作用。并且,CD3AK作用后,HepG2細胞bcl-2mRNA的表達水平進一步明顯下降,表明CD3AK的殺傷機制與下調(diào)靶細胞的bcl-2mRNA表達水平有關(guān)。 4.HepG2細胞內(nèi)VEGF呈高水平表達;血管內(nèi)皮細胞ECV304內(nèi)APRIL受體HSPG呈高水平表達,表明HepG2細胞所產(chǎn)生的VE6F、APRIL可能是以旁分泌形式直接作用于血管內(nèi)皮細胞上的相應(yīng)受體,發(fā)揮其促進血管內(nèi)皮細胞增殖活性。 5.IC
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