雌激素對(duì)去卵巢EAE大鼠ICAM-1、IFN-γ及BBB影響的研究.pdf

1、目的：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的破壞已成為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和人類多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)?？乖禺愋訲淋巴細(xì)胞(T lymphocyte，TLC)突破了受損的BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)釋放炎性介

2、質(zhì)，這不僅打破了CNS相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境而且成為介導(dǎo)炎癥性髓鞘脫失的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雌激素類藥物雌二醇(estradiol，E<,2>)治療Wistar大鼠去卵巢后EAE，觀察其臨床療效和潛在的免疫學(xué)機(jī)制，目的在于探討EAE的發(fā)病機(jī)制和應(yīng)用E<,2>治療EAE的作用機(jī)制，為EAE和MS的免疫病理機(jī)制提供新的理論支持，也為今后臨床應(yīng)用雌激素輔助治療MS等CNS自身免疫性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：制備去卵巢后10天的EAE動(dòng)物模型

3、，隨機(jī)分為EAE組、E<,2>治療組和佐劑組。E<,2>治療組從免疫后(post-inoculation，p.i.)0～5天每日肌注E<,2>(250 μ g/kg)一次。觀察各組在不同時(shí)間點(diǎn)的血清E<,2>濃度及血清和腦脊液中白蛋白含量比值(CSF to serum albumin quotient，QA)，通過(guò)QA評(píng)定BBB的損害。按照國(guó)際通用的五分法評(píng)估臨床癥狀，觀察體重變化、發(fā)病率等臨床指標(biāo)。在P.i.6、8、10、12、14、

4、16天處死動(dòng)物，取腦和脊髓用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CNS中不同部位細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular adhension molecule-1， ICAM-1)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的表達(dá)，并對(duì)EAE組ICAM-1和IFN-γ進(jìn)行相關(guān)分析。 結(jié)果： 1．大鼠去卵巢后血清E<,2>水平在短時(shí)間(16天)內(nèi)迅速下降，經(jīng)E<,2>(250 μ g/kg．d)連續(xù)補(bǔ)充6天后其水平迅速升高，當(dāng)

5、E<,2>補(bǔ)充停止其又以較快的速度(6天)代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。在P.i.6天，EAE組血清E<,2>水平為38.68±6.87pmol/l，較未去卵巢大鼠(137.60±20.95pmol/l)顯著下降(t=10.03，P<0.01)表明去卵巢手術(shù)成功。在P．i．6天、P．i．8天、P．i．10天，E<,2>治療組血清E<,2>水平較EAE組顯著升高，分別為1981.40±95.36pmol/l、499.20±16.67pmol/

6、l、161.00±11.36pmol/l，與EAE組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1666.49，P<0.01)。在P．i．12天，E<,2>治療組血清E<,2>代謝至33.18±10.92pmol/l，處于去卵巢后低水平狀態(tài)。 2．EAE組發(fā)病率73％，平均體重減輕15.40±4.03g，平均癥狀評(píng)分2.07±1.67分，平均病灶數(shù)15.00±1.93個(gè)，平均發(fā)病日期13.60±1.18天。在P．i．12天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，起病

7、突然，發(fā)病輕重不一，表現(xiàn)有尾麻痹、后肢無(wú)力、體重下降等。在P．i．14天左右發(fā)展為發(fā)病高峰期，進(jìn)一步表現(xiàn)為后肢癱瘓、易激惹、體重迅速下降，個(gè)別處于瀕死狀態(tài)。在p.i．16天左右病情開(kāi)始緩解，臨床癥狀減輕，體重開(kāi)始回升，相應(yīng)的臨床癥狀評(píng)分、發(fā)病率下降。E<,2>治療組發(fā)病率27％，較EAE組降低(x<'2>=6.53，P<0.05)；平均體重減輕6.73±3.53g，較EAE組減少(t=6.26，P<0.01)；平均癥狀評(píng)分0.53±0.

8、92分，較EAE組降低(t=2.93，P<0.01)；平均病灶數(shù)7.67±3.15個(gè)，較EAE組減少(t=7.68，P<0.01)；平均發(fā)病日期15.07±0.88天，較EAE組延遲(t=3.85，P<0.01)。這5項(xiàng)臨床指標(biāo)比較，E<,2>治療組與EAE組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。佐劑組未見(jiàn)發(fā)病，體重呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。 3.EAE組、E<,2>治療組和佐劑組QA值均出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。EAE組在p.i.8天時(shí)QA值達(dá)到最大值(0.3

9、1±0.07)，BBB受損較重，之后隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，QA值逐漸下降，BBB的功能逐漸恢復(fù)。E<,2>治療組免疫后初期QA值僅有小幅度的增加，在以后的免疫時(shí)間里QA值緩慢增高，在p.i.14天時(shí)達(dá)到最大值(0.20±0.04)，但增幅較小，出現(xiàn)峰值的時(shí)間較EAE組延遲，BBB受損較輕。佐劑組QA值在免疫后初期雖然也出現(xiàn)增高，但升高幅度明顯低于EAE組。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.6～16天，EAE組與E<,2>治療組比較

10、QA值總的變化趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=26.20，P<0.01)；EAE組與佐劑組比較QA值總的變化趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.78，P<0.01)。 4.ICAM-1在EAE組、E<,2>治療組和佐劑組的血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)程度與病情輕重相一致。當(dāng)其表達(dá)增加時(shí)，表現(xiàn)為在扁平的血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍著色加深。經(jīng)圖像分析顯示，EAE組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值在p.i.14天時(shí)達(dá)到最小值131.87±18.56，此時(shí)E<,2>

11、治療組也有所下降(153.20±15.41)，但下降較緩慢，與EAE組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=26.67，P<0.01)。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.10～16天，EAE組與E<,2>治療組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.01，P<0.01)，表明E<,2>治療組ICAM-1表達(dá)明顯低于EAE組；在p.i.10～16天，EAE組與佐劑組ICAM-1陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=159.93

12、，P<0.01)，表明EAE組ICAM-1的表達(dá)明顯高于佐劑組。 5.IFN-γ主要由進(jìn)入CNS的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為血管滲出的淋巴細(xì)胞周圍有不同程度著色，且表達(dá)程度與病情輕重相一致。經(jīng)圖像分析顯示，EAE組IFN-γ陽(yáng)性染色平均灰度在p.i.14天時(shí)達(dá)到最小值116.21±19.26，此時(shí)E<,2>治療組也有所下降(138.28±17.37)，但下降較緩慢，與EAE組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=19.28，P<

13、0.01)。經(jīng)兩因素多水平方差分析統(tǒng)計(jì)表明：在p.i.10～16天，EAE組與E<,2>治療組IFN-γ陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=26.19，P<0.01)，表明E<,2>治療組IFN-γ表達(dá)明顯低于EAE組；在p.i.10～16天，EAE組與佐劑組IFN-γ陽(yáng)性染色平均灰度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=196.56，P<0.01)，表明EAE組IFN-γ的表達(dá)明顯高于佐劑組。相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析顯示：在p.i.6～p.i.16天，EA

14、E組ICAM-1與IFN-γ的陽(yáng)性表達(dá)具有顯著正相關(guān)性(r=0.87，P<0.01). 結(jié)論： 1.去卵巢后EAE血清E<,2>水平降低，經(jīng)E<,2>補(bǔ)充后明顯升高，當(dāng)E<,2>補(bǔ)充停止后又以較快的速度代謝至去卵巢后低水平狀態(tài)。 2.繼早期BBB損傷高峰之后，EAE臨床癥狀開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸加重。 3.EAE早期(p.i.8～10天)EC已有少量ICAM-1表達(dá)，在p.i.14天時(shí)表達(dá)最大，說(shuō)明病情處于較重期