雌激素及PTH對(duì)去卵巢大鼠脊柱Wnt-β-catenin通路表達(dá)及退變程度的影響.pdf

1、【目的】
　　研究大鼠卵巢切除后及雌激素和PTH補(bǔ)充治療對(duì)腰椎Sclerostin、Wnt/β-catenin通路表達(dá)以及骨強(qiáng)度和骨量的作用；研究雌激素和PTH對(duì)大鼠卵巢切除導(dǎo)致的間盤退變的緩解作用及機(jī)制，以及間盤退變和藥物干預(yù)后Wnt/β-catenin的變化情況；從椎體和椎間盤兩個(gè)方面綜合評(píng)估大鼠卵巢切除及雌激素和PTH干預(yù)后脊柱的退變情況以及退變過程中Wnt/β-catenin的變化情況。
　　【方法】
　　第一

2、部分：選取3月齡雌性SD大鼠，分為偽手術(shù)組（Sham組）、單純對(duì)照組（OVX組）、雌激素組（OVX+E2組）、PTH組（OVX+PTH組）和聯(lián)合治療組（OVX+E2+P TH組），行卵巢切除造模。術(shù)后正常飼養(yǎng)8周，第9周開始各組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予藥物干預(yù)12周。干預(yù)結(jié)束后測量大鼠腰椎骨密度，處死后取材，分別取各組L1檢測MEF2A、MEF2C、MEF2D和SOST的mRNA表達(dá)量；取L2檢測椎體Sclerostin表達(dá)量；取L3行Scler

3、ostin和β-catenin免疫組化染色，并進(jìn)行骨細(xì)胞密度測定；取L4行Micro-CT掃描評(píng)價(jià)骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)；取L5行生物力學(xué)測試；取L6行Western blot檢測β-catenin蛋白含量；取血清檢測P1NP及CTX-1。第二部分：選取3月齡雌性SD大鼠，分為Sham組、OVX組、OVX+E2組和OVX+PTH組，行卵巢切除術(shù)制造低雌激素性間盤退變模型。術(shù)后第9周開始各組按相應(yīng)干預(yù)處理12周后取材。分別獲取各組動(dòng)物T12/L1

4、及L1/2椎間盤行RT-PCR檢測間盤組分及Wnt/β-catenin通路表達(dá)情況；取L2/3及L4/5椎間盤的髓核部分，提取核蛋白檢測β-caten in表達(dá)量；對(duì)L5/6間盤行HE染色和免疫組化染色評(píng)價(jià)間盤退變情況；取 L2利用Micro-CT分析終板退變情況；取 L3-L4節(jié)段進(jìn)行間盤生物力學(xué)測試，從功能上評(píng)價(jià)間盤退變情況。
　　【結(jié)果】
　　第一部分：
　　（1）與Sham組相比，OVX組大鼠椎體中MEF2s和

5、SOST mRNA表達(dá)增高，而OVX+E2組椎體中MEF2s和SOST mRNA表達(dá)比OVX組減低（p<0.05）。PTH能抑制MEF2s和SOST mRNA的表達(dá)量，而OVX+E2+PTH組與OVX+PTH組相比對(duì)MEF2s和SOST mRNA有更強(qiáng)的抑制作用。
　?。?）與Sham組相比，OVX組大鼠椎體中Sclerostin陽性細(xì)胞數(shù)量增多，OVX+E2組椎體Sclerostin陽性細(xì)胞數(shù)量比OVX組減少。OVX+E2+PT

6、H組椎體中Sclerostin陽性表達(dá)細(xì)胞量與OVX+PTH組相似。Western blot結(jié)果顯示OVX組Sclerostin表達(dá)量高于其余4組，而OVX+E2組Sclerostin表達(dá)量與Sham組水平接近。OVX+E2+PTH組比OVX+PTH組對(duì)Sclerostin蛋白表達(dá)有更強(qiáng)的抑制效果。
　?。?）Sham組椎體骨細(xì)胞密度為426.83±68.14＃/mm2，OVX組降低至293.53±53.24＃/mm2，而OVX+

7、E2組椎體骨細(xì)胞密度提升至377.30±48.22＃/mm2（p<0.05）。OVX+E2+PTH組的骨細(xì)胞密度是451.44±55.57＃/mm2，比OVX+PTH組（463.81±64.92＃/mm2）略低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（4）OVX組大鼠椎體中β-catenin陽性細(xì)胞比Sham組減少，而OVX大鼠經(jīng)雌激素治療后β-catenin陽性細(xì)胞數(shù)量增加。OVX+E2+PTH組椎體中β-caten in陽性成骨細(xì)胞比例

8、略高于OVX+PTH組。核蛋白Western blot結(jié)果顯示OVX組椎體β-catenin蛋白濃度最低，OVX+E2組β-catenin蛋白濃度較OVX組有所提高，但仍未達(dá)到Sham組水平。OVX+E2+PTH組β-catenin蛋白濃度比OVX+PTH組略高。
　　（5）與Sham組相比，OVX組大鼠椎體BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Conn.Dn顯著減低，而BS/BV及Tb.Sp增高（p<0.05）。OVX+E2組椎體B

9、S/BV、Tb.Th、Tb.Sp和Conn.Dn這四個(gè)指標(biāo)均恢復(fù)到了偽手術(shù)組的水平（p>0.05）。OVX+PTH組椎體BV/TV和Tb.Th高于Sham組，而OVX+E2+PTH組與OVX+PTH組結(jié)構(gòu)參數(shù)上的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　（6）與Sham組相比，OVX組大鼠椎體生物力學(xué)性能明顯降低，其中最大載荷減低了30.1％，剛度下降了34.5%，而斷裂吸收能減低了36.4%（p<0.05）。與OVX組相比，OV

10、X+E2組大鼠椎體最大載荷增加了27.2%，剛度提高了28.8%，而斷裂吸收能增加了30.1%，但未恢復(fù)至Sham組水平。OVX+E2+P TH組椎體生物力學(xué)性能比OVX+P TH組有所提高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）與Sham組（0.1748±0.01056 g/cm2）相比，OVX組大鼠腰椎骨密度降低至0.1419±0.01068 g/cm2，而雌激素治療將去勢(shì)大鼠腰椎骨密度提高至0.1596±0.01396 g/cm

11、2（p<0.05）。與OVX+PTH組相比，OVX+E2+PTH組大鼠椎體骨密度有所增加（0.1909±0.0109 vs.0.1842±0.0088 g/cm2），但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）大鼠卵巢切除后血清中P1NP和CTX-1均顯著增高，OVX+E2組比 OVX組 CTX-1低17.8%，P1NP低7.2%，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OVX+E2+PTH組CTX-1和P1NP水平低于OVX+PTH組（p<0.05）。

12、r>　　第二部分：
　?。?）Sham組大鼠間盤結(jié)構(gòu)正常，髓核中細(xì)胞主要為脊索細(xì)胞。OVX組大鼠髓核中脊索細(xì)胞大量減少，部分大鼠髓核中出現(xiàn)大量聚集成簇的類軟骨細(xì)胞，纖維環(huán)出現(xiàn)明顯裂隙，纖維排列紊亂，軟骨終板內(nèi)出現(xiàn)大量異位骨樣組織。與OVX組相比，OVX+E2組和OVX+P TH組髓核內(nèi)類軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，仍主要為脊索細(xì)胞，纖維環(huán)膠原排列較規(guī)則。OVX組大鼠間盤出現(xiàn)明顯退變，組織學(xué)評(píng)分高于Sham組，雌激素和PTH治療均能降低去

13、勢(shì)大鼠間盤的組織學(xué)評(píng)分（p<0.05）。
　　（2）與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠L2上終板表面出現(xiàn)許多小凹陷，表面顆粒感強(qiáng)，平滑程度明顯變差，終板邊緣變得不規(guī)則。經(jīng)過雌激素或PTH治療的大鼠，其終板表面平滑程度得到一定恢復(fù)。Sham組L2上終板平均孔隙率為13.96%，而OVX組孔隙率降為7.88%（p<0.05）。OVX+E2組和OVX+PTH組孔隙率分別提升至10.57%和11.29%，較OVX組增加（p<0.05），但

14、仍未達(dá)到Sham組水平（p<0.05）。
　?。?）與Sham組相比，OVX組Aggrecan、Col2a1 mRNA表達(dá)降低，而Col1a1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達(dá)升高（p<0.05）。與OVX組相比，OVX+E2組和OVX+PTH組Aggrecan、Col2a1 mRNA表達(dá)提高，而Col1a1、MMP-3和MMP-9 mRNA表達(dá)降低（p<0.05）。OVX組Aggrecan和II型膠原染色強(qiáng)度低于Sham組，

15、而MMP-3染色強(qiáng)度高于Sham組。與OVX組相比，OVX+E2組和OVX+PTH組Aggrecan和II型膠原染色強(qiáng)度增高，而MMP-3染色強(qiáng)度減低。
　?。?）與Sham組相比，OVX組β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA表達(dá)減低（p<0.05），表明去勢(shì)引起間盤退變過程中伴隨著間盤內(nèi) Wnt/β-catenin通路表達(dá)的下調(diào)。而OVX+E2組和OVX+PTH組間盤內(nèi)β-catenin、c-myc和cy

16、clin D1 mRNA表達(dá)均高于OVX組（p<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示Sham組能觀察到髓核細(xì)胞β-catenin染色，而OVX組β-catenin染色強(qiáng)度明顯低于Sham組。與OVX組相比，OVX+E2組和OVX+PTH組髓核細(xì)胞β-catenin染色強(qiáng)度增強(qiáng)。大鼠髓核細(xì)胞核內(nèi)β-catenin Western-Blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　【結(jié)論】
　?。?）Sclerostin受雌激素的調(diào)節(jié)，其中可能涉及

17、對(duì)MEF2的調(diào)控。雌激素與PTH聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MEF2s及Sclerostin的抑制效果優(yōu)于PTH單獨(dú)應(yīng)用。
　　（2）雌激素和PTH能夠提高Wnt/β-catenin通路活性，且雌激素與PTH聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用對(duì)Wnt/β-catenin通路有更強(qiáng)的激活作用。
　?。?）與PTH單獨(dú)應(yīng)用相比，在大鼠腰椎骨量及力學(xué)性能上雌激素與PTH聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果無明顯差異。
　?。?）去勢(shì)大鼠終板內(nèi)髓竇體積減小，異位骨化程度提高，對(duì)間盤

18、營養(yǎng)狀態(tài)也有不良的影響，Aggrecan和II型膠原含量降低，而I型膠原、MMP-3和MMP-9表達(dá)升高，間盤出現(xiàn)退變。而雌激素和PTH能夠提高終板內(nèi)髓竇體積，改善間盤營養(yǎng)供應(yīng)，提高Aggrecan和II型膠原含量，從而改善間盤退變程度。
　　（5）去勢(shì)大鼠髓核中脊索細(xì)胞逐漸消失，發(fā)生類軟骨細(xì)胞化生，伴有Wnt/β-catenin通路表達(dá)降低。雌激素和PTH均能保持髓核中脊索細(xì)胞的數(shù)量，減少類軟骨細(xì)胞數(shù)量，提高髓核中Wnt/β-c