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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:通過(guò)過(guò)表達(dá)或抑制microRNA-21(miR-21)在SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SD-BMSCs(MSCs)內(nèi)的表達(dá),評(píng)估其在治療心肌梗死的效果上的變化,并研究其作用機(jī)制。
方法:采用全骨髓差異貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠MSCs至第4代,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR21-agomir(過(guò)表達(dá))及miR-21 antagomir(抑制)調(diào)控miR-21在MSCs內(nèi)的表達(dá),轉(zhuǎn)染成功后收集細(xì)胞并收集條件培養(yǎng)基,用于后續(xù)研究。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
2、中,建立SD大鼠心肌梗死模型后,采用心肌內(nèi)注射方法,分別將MSCsmiR-21 agomir組、MSCsmiR-21 antagomir組、MSCs未轉(zhuǎn)染組及PBS移植至心梗及周邊區(qū)域,通過(guò)檢測(cè)大鼠心梗后心功能變化及心梗面積評(píng)估治療效果。體外實(shí)驗(yàn)中,購(gòu)買(mǎi)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞,子宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞。以Hela細(xì)胞為載體,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-21的靶點(diǎn)是否為Jagged1。同時(shí)利用收集的M
3、SCs轉(zhuǎn)染組產(chǎn)生的培養(yǎng)基和MSCs未轉(zhuǎn)染組產(chǎn)生的培養(yǎng)基及含有10%FBS+雙抗的DMEM/HIGH培養(yǎng)基(空白對(duì)照),用作以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn),一是處理HUVEC細(xì)胞72小時(shí)后在Matrigel基質(zhì)膠上培養(yǎng),于12小時(shí)觀察成管樣結(jié)構(gòu);二是處理H9C2細(xì)胞72h后加入CCK-8溶液孵育1個(gè)小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中: MSCsmiR-21antagomir組平均LVEF(%)變化值:17.14±2.63, MSCs mi
4、R-21 agomir組LVEF(%)變化值:13.09±1.74,MSCs未轉(zhuǎn)染組LVEF(%)變化值:13.34±2.25,三組與對(duì)照組LVEF(%)變化值:7.09±4.23相比,心功能恢復(fù)效果更佳,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),三組之中,MSCsmiR-21antagomir組與心功能恢復(fù)效果最佳,與其他兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)Masson染色分析心梗面積發(fā)現(xiàn)心梗區(qū)域纖維化組織與正常心肌面積所占橫截面外
5、周徑比值(%):MSCsmiR-21 antagomir組最小,為10.50±3.15,與MSCsmiR-21 agomir15.91+4.12、MSCs未轉(zhuǎn)染組20.34±3.25、PBS組37.09±6.23均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。心梗區(qū)域纖維化組織與正常心肌面積所占橫截面面積比值(%) MSCsmiR-21 antagomir組同樣最小,為8.31±2.35,與MSCsmiR-21 agomir組19.91+4.93、MS
6、Cs普通組25.14±2.19、PBS組31.04±5.93均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)miR-21可與Jagged1的mRNA3’UTR段結(jié)合,說(shuō)明miR-21對(duì)Jagged1具有調(diào)控作用。qRT-PCR顯示,轉(zhuǎn)染miR-21 antagomir的MSCs內(nèi)的Jagged1、NOTCH、VEGF等基因全部上調(diào)。體外管樣生成實(shí)驗(yàn)中,MSCsmiR-21 agomir培養(yǎng)基組體外管樣結(jié)構(gòu)連接長(zhǎng)度(1
7、1976.14±866.62)與MSCsmiR-21 antagomir培養(yǎng)基組(12196.52±858.00)、MSCs未轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基組(12275.09±561.74)之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但三組與空白組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);CCK8實(shí)驗(yàn)中,抑制了miR-21在MSCs內(nèi)的表達(dá)后,其條件培養(yǎng)基促心肌增殖的能力得到了明顯的增強(qiáng)。
結(jié)論:抑制了miR-21在MSCs內(nèi)的表達(dá)后,其治療心肌梗死的能力得
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