免疫突觸的形成對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中巨噬細(xì)胞凋亡率影響的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以多關(guān)節(jié)慢性滑膜炎、關(guān)節(jié)損傷和骨破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，同時(shí)，亦是一種慢性炎癥性機(jī)能紊亂，主要包括滑膜襯里層增生肥大導(dǎo)致的巨噬樣滑膜細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)、大量血管新生及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。已有大量證據(jù)證明在RA滑液和增生的滑膜中存在著大量的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞不僅能產(chǎn)生大量的前炎性因子，又可產(chǎn)生大量的趨化因子，從而與RA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，并最終導(dǎo)致炎癥加

2、劇和關(guān)節(jié)破壞。此外，在RA體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可作為抗原提呈細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞相互結(jié)合，產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞活化的超分子結(jié)構(gòu)-免疫突觸（Immunological synapse,IS），活化其體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的同時(shí)也將自我活化，活化后的巨噬細(xì)胞分泌大量的IL-1、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子促進(jìn)RA的病情進(jìn)展，當(dāng)大量的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞過(guò)度活化、過(guò)量增殖時(shí)則可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化綜合癥（macrophage activation syndrome,MA

3、S），從而危及患者生命。因此，將巨噬細(xì)胞作為治療RA的主要治療靶點(diǎn)，探索抑制巨噬細(xì)胞活化、促進(jìn)其凋亡的途徑將對(duì)RA的治療起到導(dǎo)向性的作用。有研究報(bào)道，人體內(nèi)IS的形成能抑制參與其形成的抗原提呈細(xì)胞-DC細(xì)胞的凋亡率，那么，在RA患者體內(nèi)大量存在的巨噬細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞參與IS的形成后，是否會(huì)降低其在RA體內(nèi)的凋亡率，使其生存時(shí)間延長(zhǎng)？國(guó)內(nèi)外無(wú)相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，有研究證明臨床常用于治療RA的免疫抑制劑環(huán)孢素A(Cyclosporin A,

4、CsA)有抑制單核細(xì)胞株THP-1參與的IS形成的作用，而CsA對(duì)巨噬細(xì)胞參與的IS的形成是否同樣有抑制作用？同時(shí)，在RA體內(nèi)呈顯著高表達(dá)的CsA的配體親環(huán)素A（Cyclophilin A,CypA）對(duì)IS的形成及功能是否有影響？國(guó)內(nèi)外也無(wú)相關(guān)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
　　【目的】
　　本課題旨在研究：
　　1、觀察由THP-1單核細(xì)胞株誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞與JurkatT細(xì)胞共培養(yǎng)形成IS后巨噬細(xì)胞的凋亡率較單

5、獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的凋亡率的變化情況。
　　2、探討在RA患者體內(nèi)大量存在，且其數(shù)量及活化程度與RA患者的病情嚴(yán)重程度存在一致性的巨噬細(xì)胞參與IS的形成后，對(duì)其自身凋亡的影響。
　　3、研究在RA患者體內(nèi)呈高表達(dá)的CypA對(duì)IS調(diào)控的巨噬細(xì)胞凋亡的影響作用。
　　4、進(jìn)一步探討與CypA為配受體關(guān)系且臨床常用于治療RA的免疫抑制劑CsA對(duì)IS調(diào)控的巨噬細(xì)胞凋亡的影響作用。
　　【方法】
　　大致分為二部分：<

6、br>　　1、將單核細(xì)胞株THP-1經(jīng)PMA刺激誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并用葡萄球菌腸毒素(SEB)(100ng/ml）包被后與活化的JurkatT細(xì)胞共培養(yǎng)促IS形成，之后將共培養(yǎng)體系置于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)凋亡，16小時(shí)之后以AnnexinV-PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡情況、TUNEL凋亡檢測(cè)法觀察巨噬細(xì)胞的凋亡情況。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以單獨(dú)無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞作為對(duì)照。同時(shí)，觀察加或不加

7、CypA（200ng/ml）、CsA(1ug/ml)對(duì)IS調(diào)控的巨噬細(xì)胞凋亡的影響。
　　2、臨床收集10例健康對(duì)照及10例活動(dòng)期確診RA患者外周血，采用免疫磁珠法分離CD4+T細(xì)胞后置于抗CD3抗體包被的24孔板中誘導(dǎo)活化24小時(shí)，之后將其與誘導(dǎo)分化后的巨噬細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)促IS形成，同時(shí)設(shè)加或不加CypA（200ng/ml）、CsA(1ug/ml)組。之后將共培養(yǎng)體系移入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)凋亡16小時(shí)后Anne

8、xinV-PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡情況、TUNEL凋亡檢測(cè)法觀察巨噬細(xì)胞的凋亡情況。數(shù)據(jù)采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
　　【結(jié)果】
　　1、流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-PI法檢測(cè)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的凋亡率結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的凋亡率為(61.4±2.4)％，參與IS的形成后巨噬細(xì)胞的凋亡率下降至(32.9±2.8)％(P<0.05)，在突觸形成過(guò)程中加入CypA(200ng/ml)則進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞

9、的凋亡率至(27.2±2.1)％(P<0.05)。而在突觸形成的過(guò)程中加入CsA(1ug/ml)使巨噬細(xì)胞的凋亡率由突觸形成時(shí)的(32.9±2.8)％回升至(48.8±2.0)％(P<0.05)。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-PI法檢測(cè)RA及健康對(duì)照巨噬細(xì)胞的凋亡率結(jié)果顯示：RA患者外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞在無(wú)血清RPMI-1640中培養(yǎng)16h后其凋亡率為(24.1±9.7)％，明顯低于由正常對(duì)照外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)

10、的巨噬細(xì)胞的凋亡率(37.1±12.5)％(P<0.05)，當(dāng)參與形成IS后該種巨噬細(xì)胞的凋亡率由(24.1±9.7)％下降至(15.2±5.5)％(P<0.001)。在突觸形成的過(guò)程中加入CypA則進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞的凋亡率至(13.7±3.9)％(P<0.05)。而在突觸形成的過(guò)程中加入CsA(1ug/ml)使巨噬細(xì)胞的凋亡率由參與突觸形成時(shí)的(15.2±5.5)％回升至(19.3±6.1)％(P<0.01)。在健康對(duì)照，IS的形成

11、對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在突觸形成的過(guò)程中加入CsA、CypA對(duì)巨噬細(xì)胞的凋亡率的影響均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：RA患者中單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率為(26.5±4.4)％，參與IS形成后TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率降至(19.0±5.1)％（P<0.01）。在突觸形成的過(guò)程中加入CypA后，巨噬細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)一步降至(18.2

12、±2.6)％（P<0.05），但在突觸形成的過(guò)程中加入CsA則使巨噬細(xì)胞的TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率回升至(30.8±4.3)％（P<0.05）。在健康對(duì)照單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率為(35.0±7.3)％，較RA患者單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率（26.5±4.4)％有明顯升高（P<0.05），同時(shí)，健康對(duì)照及細(xì)胞株組中，參與IS形成的巨噬細(xì)胞TUNEL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞百分率較單獨(dú)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記

13、陽(yáng)性細(xì)胞百分率有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余健康對(duì)照組及細(xì)胞株各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【結(jié)論】
　　1、經(jīng)超抗原SEB包被的THP-1細(xì)胞株來(lái)源的巨噬細(xì)胞與活化的JurkatT細(xì)胞形成IS后，巨噬細(xì)胞的凋亡率顯著減少，即表明IS的形成可抑制參與其形成的巨噬細(xì)胞的凋亡率。
　　2、RA患者來(lái)源的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間IS的形成可顯著的抑制巨噬細(xì)胞的凋亡率，即促使巨噬細(xì)胞凋亡減少、生存時(shí)間延長(zhǎng)。
　　3、在R