TOP2A、DUSP6基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性、腫瘤退縮率及預(yù)后相關(guān)因素研究.pdf

1、目的：
　　本研究采取以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究方法，共計(jì)收錄了有明確病理診斷的NSCLC病人456例，健康對(duì)照組462例。研究的第一部分探討TOP2A rs471692、DUSP6 rs2279574多態(tài)性與中國漢族人群肺癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性?；谶x取位點(diǎn)所在基因功能與細(xì)胞增殖相關(guān)，可能同時(shí)影響肺癌的放射敏感性及預(yù)后，所以本研究的第二部分是探討基因多態(tài)性與NSCLC預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。第三部分探討放療中腫瘤退縮率與這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)

2、聯(lián)性，并對(duì)行根治性放療治療為主的Ⅰ-Ⅲ期NSCLC病人，探討性別、年齡、腫瘤生長部位、腫瘤體積、病理類型、分期等臨床病理因素及放療中腫瘤退縮速率與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：
　　一、研究對(duì)象
　　1、TOP2A、DUSP6基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性的相關(guān)性研究
　　研究對(duì)象為相互間無血緣關(guān)系的中國北方漢族人群（以遼寧省為中心，包括周圍臨近地區(qū)），均簽署知情同意書，提供血液標(biāo)本同時(shí)，完成流行病學(xué)調(diào)查。采用病

3、例對(duì)照研究方法，病例組來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽軍區(qū)總醫(yī)院和遼寧省腫瘤醫(yī)院的456名NSCLC患者，有明確的病理診斷，462名對(duì)照來自同期沈陽軍區(qū)總醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，性別與病例頻數(shù)匹配。因2名NSCLC患者和8名健康對(duì)照者基因分型失敗，最終共計(jì)454例NSCLC和健康對(duì)照納入研究，所有病例和對(duì)照均在2009年6月至2012年12月期間募集。
　　2、TOP2A、DUSP6基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的相關(guān)性研究
　

4、　研究對(duì)象為在2009年6月至2012年12月期間來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽軍區(qū)總醫(yī)院和遼寧省腫瘤醫(yī)院的454名原發(fā)性肺癌患者，失訪15例，共計(jì)429例病人納入研究，入組研究的病例均有明確的病理診斷，其中男314例，女115例;年齡34～87歲，平均60歲，均取得病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷，鱗癌228例，腺癌201例，Ⅰ期59例，Ⅱ期67例，Ⅲ期208例，Ⅳ期92例，非手術(shù)病人227例，手術(shù)病人152例。
　　3、非小細(xì)胞肺癌放療

5、中腫瘤退縮率與TOP2A、DUSP6基因多態(tài)性及預(yù)后的相關(guān)性研究
　　研究對(duì)象為在2009年6月至2012年12月期間來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的原發(fā)性肺癌患者，共計(jì)140例病人納入研究，入組研究的病例均有明確的病理診斷，其中男105例，女35例;年齡31～82歲，平均60歲，均取得病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷，鱗癌89例，腺癌51例，Ⅰ期6例，Ⅱ期36例，Ⅲ期76例，Ⅳ期22例，原發(fā)NSCLC病人106例，術(shù)后復(fù)發(fā)34例。
　　二

6、、研究方法
　　采用統(tǒng)一制定調(diào)查表，由兩名培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)病例及對(duì)照進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括每個(gè)研究對(duì)象詳細(xì)的流行病學(xué)資料，包括年齡，性別，體重，吸煙史，飲食等生活習(xí)慣，家族患癌史，職業(yè)史等。臨床資料包括:確診時(shí)間，手術(shù)時(shí)間，放療或化療時(shí)間，復(fù)發(fā)時(shí)間，死亡時(shí)間，腫瘤部位，病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期，治療策略等。非吸煙者指終生吸煙少于100支的個(gè)體，現(xiàn)在吸煙者指發(fā)病前12個(gè)月內(nèi)仍在吸煙者，其余則歸為曾經(jīng)吸煙者?；颊叩碾S訪記

7、錄通過門診，電話隨訪或病案查閱的方式進(jìn)行。
　　行三維適形放療的NSCLC病人，用放射治療計(jì)劃系統(tǒng)計(jì)算放療前原發(fā)腫瘤靶體積(GTV)，放療40Gy/20f后，重新進(jìn)行CT定位復(fù)查，在計(jì)劃系統(tǒng)中采用交互信息法進(jìn)行CT-CT配準(zhǔn)（放療40 Gy的CT與放療前CT配準(zhǔn)），參考配準(zhǔn)圖像進(jìn)行靶區(qū)勾畫，根據(jù)腫瘤大小變化重新勾畫腫瘤靶區(qū)GTVs。
　　所有參與研究的個(gè)體外周血標(biāo)本采集使用枸櫞酸鈉抗凝試管，每人采血約2ml，經(jīng)-20℃或-8

8、0℃冰箱的凍存，集中進(jìn)行基因組DNA提取，方法采用酚-氯仿法，提取后測(cè)OD值確定DNA的原始濃度，再倍比稀釋到30-100ng/μl的終濃度備用。采用Taqman real-time PCR方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的基因分型。
　　三、統(tǒng)計(jì)分析
　　利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。以x2檢驗(yàn)檢查比較人口學(xué)特征、相關(guān)危險(xiǎn)因素暴露及SNPs基因型在病例與對(duì)照之間分布的差

9、異;以擬合優(yōu)度x2檢驗(yàn)檢查對(duì)照的Hardy-Weinberg分布平衡情況;以單因素和多因素logistic回歸計(jì)算比值比(oddsratio，OR)及95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。用Haploview軟件計(jì)算SNPs的連鎖不平衡指數(shù)?；?吸煙之間的交互作用根據(jù)Likelihood ratio檢驗(yàn)計(jì)算。生存時(shí)間定義為確診日期至死亡日期或最近一次隨訪日期（2014年1月）。以Kaplan-Meier方法繪

10、制生存曲線并以Log-rank檢驗(yàn)生存時(shí)間之間的差異。單因素和多因素Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比例(Hazard Ratios，HR)及其95％可信區(qū)間(Confidence Intervals，CI)?？ǚ綑z驗(yàn)被用來分析死亡和存活的患者不同變量之間的差異。以t檢驗(yàn)和方差分析分別比較性別、年齡、療前體重下降程度、KPS評(píng)分、腫瘤部位、病理類型、分期及基因型與放療中腫瘤退縮率關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　本研究第一部分檢測(cè)的2個(gè)SNPs基因

11、型在對(duì)照組的分布頻率經(jīng)x2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05）。DUSP6 rs2279574有三種單體型，C/C（野生型）、C/A型、A/A型。以rs2279574的基因分型情況進(jìn)行Logistic回歸分析表明，相對(duì)于C/C基因型攜帶者，攜帶A/A和A/C基因型者的OR及95％CI分別為1.571(1.050-2.349)和1.415(0.948-2.112)，P值分別為0.028和0.090;合并A/A

12、和C/A后的OR及95％CI為1.489(1.022-2.169)。調(diào)整年齡、吸煙狀況因素后上述OR及95％CI分別為1.836(1.180-2.857)、1.758(1.131-2.731)、1.796(1.187-2.716)，P值分別為0.007，0.012和0.006;提示rs2279574位點(diǎn)的A等位基因是肺癌的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，攜帶A/A和C/A單體型的個(gè)體發(fā)生肺癌的危險(xiǎn)增加。進(jìn)一步根據(jù)組織學(xué)分層發(fā)現(xiàn)，A/A和C/A基因型增加肺

13、鱗癌風(fēng)險(xiǎn)，OR值和95％CI分別為2.270(1.268-4.062)和2.096(1.175-3.741)，同時(shí)合并A/A和C/A基因型的OR值和95％CI為1.564(0.977-2.503)，調(diào)整年齡、吸煙狀況因素后上述OR及95％CI分別為2.270(1.268-4.062)、2.096(1.175-3.741)、2.180(1.263-3.761)，P值分別為0.006，0.012和0.005;提示rs2279574單核苷酸多

14、態(tài)性的A等位基因是肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，攜帶A/A和C/A單體型的個(gè)體發(fā)生肺鱗癌的危險(xiǎn)增加。
　　本研究的第二部分是探討TOP2A和DUSP6基因多態(tài)性與NSCLC預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)454例NSCLC患者進(jìn)行隨訪，截止2014年1月，中位隨訪期為19個(gè)月（1～84個(gè)月），15例失訪，隨訪率為94.5％。利用Cox多重回歸模型分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)率(Hazard Ratio，HR)、P值、中位生存期(Median Survival Time，

15、MST)、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank Test)P值和Kaplan-Meier生存曲線等數(shù)據(jù)分析?？ǚ綑z驗(yàn)被用來分析死亡和存活的患者不同變量之間的差異。總共有429例進(jìn)入分析，在這些NSCLC患者中有323例(75.3％)死亡，106例存活，中位生存期(MediumSurvival Time，MST)為19個(gè)月，1、2、3年生存率分別為65.2％、44.2％、31.9％。
　　第三部分研究探討放療中腫瘤退縮率與這兩個(gè)位點(diǎn)的單核甘

16、酸多態(tài)性的關(guān)系，本研究中NSCLC患者共140例，TOP2A rs471692位點(diǎn)基因型C/C、C/T、T/T分布頻率分別是47.9％、45.7％、6.4％; DUSP6 rs2279574位點(diǎn)基因型A/A、A/C、C/C分布頻率分別是46.4％、42.9％、10.7％。各基因型與研究對(duì)象的性別、年齡、吸煙狀態(tài)、腫瘤部位、T分期、N分期、臨床分期及病理類型均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。放療中期腫瘤退縮率平均值為0.34cm3，其中有3

17、例患者放療中期腫瘤體積GTVs較放療前體積GTV增大。TOP2A rs471692 C/C、C/T、T/T基因型攜帶者放療中期腫瘤平均退縮率分別為35.5％、33.8％、45.7％，經(jīng)方差分析比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.455 P=0.237)。合并C/T、T/T基因型，與攜帶C/C基因型個(gè)體比較，經(jīng)t檢驗(yàn)分析也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.634，P=0.105)。
　　結(jié)論：
　　1、DUSP6 rs2279574位點(diǎn)基因多態(tài)性

18、與肺癌易感性相關(guān)，攜帶A等位基因可增加肺鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且和中晚期肺癌相關(guān)。
　　2、DUSP6 rs2279574位點(diǎn)基因多態(tài)性與行放化療治療為主的非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)，攜帶突變純合型(AA)基因型為預(yù)后不良因素。
　　3、DUSP6、TOP2A基因多態(tài)性與NSCLC放療中腫瘤退縮率無關(guān)聯(lián)。放療中腫瘤退縮率、療前體重下降程度、臨床分期、是否吸煙與行根治性放療治療為主的局部早期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)，放療中腫瘤退縮率較慢為預(yù)后