錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH3在家族性結(jié)直腸癌和食管癌中的作用.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH3在家族性結(jié)直腸癌和食管癌中的作用姓名：劉宏旭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：殷洪年2003.4.1單位的AmpliTaqGOLD聚合酶。DHPLC主要原理為：將退火處理后的PCR樣品置于TransgenomicWaveDNA片段分析儀中。自動(dòng)采取lO一樣品注入DNA層析柱，PCR產(chǎn)物在流動(dòng)相以09ml／min的速度帶至DNA層析柱，在一定溫度和乙腈的線性梯度下，具有不同特性的DNA雙

2、鏈得以分離，并可被紫外線吸收儀在波長(zhǎng)為254nm處檢測(cè)到，表現(xiàn)為特征性的洗脫峰(elutionpeak)。純合的野生型DNA表現(xiàn)為單一窄峰，而突變型和野生型DNA組成的雜合子樣品則表現(xiàn)為提前出現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)的額外洗脫峰，從而得以鑒別。整個(gè)方法的核心是層析柱所處的溫度(異源雜合雙鏈和純合雙鏈得以分離的溫度)和流動(dòng)相緩沖液的梯度，主要是利用WAVEMAKERTM34軟件，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小和組成特點(diǎn)，來計(jì)算和調(diào)整。測(cè)序(1)重新進(jìn)行PCR

3、擴(kuò)增；(2)用QIAquickPCRPurificationKit(PCR純化試劑盒)進(jìn)行純化；(3)直接測(cè)序，采用BigDyeTerminatorV30ReadyReactionCycleSequencingKit進(jìn)行雙向測(cè)序反應(yīng)。(4)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酒精沉淀后在ABIPRISM377DNA測(cè)序儀上電泳，以測(cè)出堿基序列。對(duì)有基因突變的索引病人所在的結(jié)直腸癌家族，針對(duì)每一名成員(包括發(fā)病和未發(fā)病者)，檢測(cè)血液和腫瘤標(biāo)本DNA中hMLH3的致

4、病性突變，進(jìn)行家系分離(segregation)研究，并與散發(fā)性結(jié)直腸癌病例和正常對(duì)照相比較，建立基因型(基因突變)和表現(xiàn)型(結(jié)直腸癌)問的某種聯(lián)系。㈡對(duì)于食管癌家系選擇標(biāo)準(zhǔn)：(1)至少兩代；(2)至少兩個(gè)食管癌患者；(3)～級(jí)親屬；(4)發(fā)病年齡較年輕(50歲)。對(duì)收集的lO個(gè)食管癌家族(4個(gè)來自國內(nèi)，6個(gè)來自瑞典)共66名成員，針對(duì)每一名成員(包括發(fā)病和未發(fā)病者)，檢測(cè)血液和腫瘤標(biāo)本DNA中hMLH3的致病性突變，進(jìn)行家系分離研究，