長沙地區(qū)MRSA的流行病學(xué)研究及femA基因的克隆和原核表達(dá).pdf

1、目的：(1)了解長沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌的耐藥特征及對(duì)甲氧西林耐藥現(xiàn)狀，為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；(2)評(píng)價(jià)苯唑西林紙片擴(kuò)散法、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、頭孢西丁瓊脂稀釋法以及顯色培養(yǎng)法檢測(cè)MRSA的臨床應(yīng)用價(jià)值；(3)分析長沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌的遺傳背景，探討其分子流行病學(xué)特征；(4)構(gòu)建金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥輔助基因femA的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)，為進(jìn)一步研究femA基因的生物學(xué)功

2、能和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)收集長沙地區(qū)11家醫(yī)院臨床分離293株金黃色葡萄球菌，應(yīng)用Vitek-2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增金黃色葡萄球菌femA基因，對(duì)分離菌株進(jìn)行基因確證；采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)23種抗菌藥物的敏感性、產(chǎn)色頭孢菌素試驗(yàn)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶以及雙紙片擴(kuò)散法（D試驗(yàn)）檢測(cè)誘導(dǎo)型克林霉素耐藥。(2)采用苯唑西林紙片擴(kuò)散法、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑

3、西林瓊脂稀釋法、頭孢西丁瓊脂稀釋法以及顯色培養(yǎng)法檢測(cè)MRSA，并與PCR檢測(cè)mecA基因作對(duì)比研究。(3)采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行同源性分析。(4)Whonet5.4及SPSS11.3軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(5)根據(jù)GenBank中的femA序列，利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)PCR引物，并在引物的5’加入BamH1及Sal1酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增出femA基因片段。將目的DNA片段及質(zhì)粒pQE

4、30分別進(jìn)行雙酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA并鑒定。將鑒定正確的pQE30-femA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并采用SDS-PAGE及Western blot分析對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：(1)293株金黃色葡萄球菌中，β-內(nèi)酰胺酶陽性273株(93.2％)；紅霉素耐藥而克林霉素敏感的28株菌中，D試驗(yàn)陽性26株(92.9％)。(2)在被檢測(cè)的23種藥物中，耐藥率

5、大于50.0％的達(dá)14種。其中，青霉素和氨芐西林耐藥率最高，均為96.6％；其次為紅霉素和克林霉素，耐藥率分別為77.1％和67.2％。敏感率高于50.0％的僅7種，以替考拉寧、萬古霉素和利奈唑胺的敏感率最高，均為100％；其次為呋喃妥因、氯霉素和多西環(huán)素，敏感率分別為97.6％、91.8％和71.0％。(3)293株金黃色葡萄球菌對(duì)23種抗菌藥物共有93種耐藥譜型，以PX1和PX2型最多，分別為47株(16.0％)和35株(11.9％

6、)，二者占所有菌株的28.0％(82/293)，是主要的流行耐藥譜型；(4)293株金黃色葡萄球菌中，MRSA190株(64.8％)，MSSA103株(35.2％)。MRSA對(duì)18種抗菌藥物的耐藥率明顯高于MSSA(P＜0.05)。(5)湘雅醫(yī)院2006年、2007年和2008年分離菌株對(duì)頭孢西丁耐藥率不同，分別為66.7％、85.0％和63.1％(P＜0.05)，對(duì)其他22種藥物耐藥率三年無明顯差異(P＞0.05)。(6)在被檢測(cè)的2

7、3種抗菌藥物中，湘雅醫(yī)院不同病區(qū)來源菌株對(duì)其中13種抗菌藥物的耐藥率存在明顯差異(P＜0.05)，而長沙地區(qū)同一時(shí)期不同醫(yī)院分離菌株對(duì)其中15種抗菌藥物的耐藥率差異明顯(P＜0.05)。(7)苯唑西林(OXA)和頭孢西丁(FOX)MIC范圍分別為0.125μg/ml～＞256μg/ml和2μg/ml～＞256μg/ml，二者M(jìn)IC50和MIC90均≥256μg/ml。(8)以mecA基因檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，5種檢測(cè)MRSA的方法敏感性和特異性均

8、超過95.5％，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.005)。(9)115株金黃色葡萄球菌共有39個(gè)PFGE分型，A型56株(48.7％)，是主要的流行菌株，其中55株為MRSA；其次為L型，共5株(4.3％)。A型分為A1～A13共13個(gè)亞型，其中又以A1亞型為主，共計(jì)26株，占22.6％(26/115)，是主要的流行克隆；在11家醫(yī)院中，有8家醫(yī)院分離到A型菌株，并且在湘雅醫(yī)院3年均分離到A1和A4亞型菌株。(10)經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及序列測(cè)定

9、，證實(shí)重組質(zhì)粒pQE30-femA構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒pQE30-femA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE和Western blot分析顯示表達(dá)出53KD目的蛋白；經(jīng)Bandscan軟件分析，目的蛋白質(zhì)在4小時(shí)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的27.5％。
　　 結(jié)論：(1)長沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，對(duì)甲氧西林呈高水平耐藥；β-內(nèi)酰胺酶陽性率、克林霉素誘導(dǎo)型耐藥率及MRSA分離率均較高。(2)長

10、沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌以PX1和PX2耐藥譜型為主，不同病區(qū)以及不同醫(yī)院分離的金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥率存在明顯差異。(3)5種表型方法均可用于檢測(cè)MRSA，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法簡便、可靠，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)MRSA的方法。(4)長沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌存在A型菌株暴發(fā)流行，A1亞型是其主要的流行克隆。相同克隆在醫(yī)院內(nèi)和醫(yī)院之間的傳播是MRSA廣泛流行的重要原因。(5)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30-femA，并在