MLL-AF9對急性單核白血病細胞增殖的影響及其分子機制的初步研究.pdf

1、第一部分: 目的: 從急性單核白血病細胞系THP-1中克隆出MLL-AF9融合基因斷裂點序列，并對其進行序列測定分析。 方法: 利用RT-PCR方法從急性單核白血病細胞系THP-1中擴增出MLL-AF9融合基因斷裂點附近序列，并用T-A克隆方法將其克隆至T載體上，經(jīng)酶切鑒定后，進行序列測定分析。 結(jié)果：從急性單核白血病細胞系THP-1克隆出了MLL-AF9斷裂點附近序列，大小為528bp，測序后示MLL基因斷裂點

2、位于外顯子9，與AF9基因外顯子5發(fā)生融合。 結(jié)論：本實驗成功克隆了THP-1細胞系MLL-AF9斷裂點的 cDNA序列，為針對該序列設(shè)計特異性的siRNA進行基因沉默實驗做準備。 第二部分： 目的：研究MLL-AF9融合基因?qū)毙詥魏税籽〖毎礣HP-1細胞增殖的影響。 方法：選擇THP-1細胞特有的MLL-AF9融合基因為靶基因，設(shè)計并合成siRNA片段。以人急性單核白血病細胞系THP-1為靶細胞，

3、應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將siRNA導入細胞，通過流式細胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法比較轉(zhuǎn)染前后MLL-AF9 mRNA表達水平的變化，MTT法檢測細胞增生抑制率，并通過Hoechst33258染色觀察siRNA作用于THP-1后細胞凋亡形態(tài)特征，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平和細胞周期的改變。 結(jié)果：siRNA轉(zhuǎn)染效率為69.1％±1.8％，轉(zhuǎn)染siRNA后MLL-AF9基因表達量大幅度減少（P<0.01），THP-1生

4、長受到明顯抑制，G0/G1期細胞增多（P<0.01），S期細胞減少（P<0.01），并使細胞周期阻滯于G0/G1期；凋亡小體增多，凋亡水平增加（P<0.01），而對照組則無上述表現(xiàn)（P>0.05）。 結(jié)論：MLL-AF9融合基因維持和促進人急性單核白血病細胞THP-1的增殖。 第三部分： 目的：研究MLL-AF9融合基因?qū)θ思毙詥魏税籽〖毎礣HP-1的p27表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。 方法：選擇THP-1

5、細胞特有的MLL-AF9融合基因為靶基因，設(shè)計并合成siRNA片段。應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將siRNA導入細胞，通過流式細胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法比較轉(zhuǎn)染前后MLL-AF9 mRNA表達水平的變化，Western Blot檢測MLL-AF9蛋白水平沉默效果，比較細胞周期抑制蛋白p27表達變化，利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）研究MLL-AF9融合蛋白是否與p2