甲基化-microRNA-MLL-AF4融合蛋白調(diào)控通路參與急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展的機(jī)理研究.pdf

1、目的：MLL(mixed lineage leukemia)基因異常是急性白血病中一種非常常見的染色體異常，大多數(shù)發(fā)生MLL基因異常的急性白血病預(yù)后很差，是血液病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。MLL-AF4陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病是成人急淋中是僅次于費(fèi)城染色體的第二大常見染色體異常，出現(xiàn)t(4；11)(q21；q23)易位，形成MLL-AF4融合基因，多數(shù)患者對(duì)常規(guī)化療耐藥，即使行異基因造血干細(xì)胞移植也容易復(fù)發(fā)，是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后不良因素。目前其發(fā)病機(jī)

2、理不清，也缺乏有效的靶向治療措施，亟需從分子機(jī)制揭示致病機(jī)理。本研究旨在探討MLL-AF4陽性急性淋巴細(xì)胞白血病中，MLL-AF4原癌基因與調(diào)控MLL-AF4的miR-143共同作用，參與MLL-AF4陽性白血病發(fā)生發(fā)展的機(jī)理。為難治復(fù)發(fā)型白血病提供新的治療靶點(diǎn)，并為去甲基化藥物治療MLL-AF4陽性急性淋巴細(xì)胞白血病奠定理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：利用microRNA靶標(biāo)反向篩選法篩選可以調(diào)控MLL-AF4融合基因的micr

3、oRNA，突變體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)microRNA通過靶向結(jié)合MLL-AF4融合基因的3’UTR(Untranslated Regions)調(diào)控MLL-AF4融合基因。實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western Blot觀察microRNA異常高表達(dá)后MLL-AF4融合基因mRNA及蛋白水平變化。MLL-AF4陽性急性白血病細(xì)胞系RS4；11及MV4-11中，轉(zhuǎn)染microRNA，觀察對(duì)MLL-AF4下游靶基因、白血病細(xì)胞凋亡、生長曲線、細(xì)胞周期

4、及細(xì)胞分化等的影響。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MLL-AF4陽性急性淋巴白血病細(xì)胞系及其他白血病細(xì)胞系中microRNA的表達(dá)情況，硫化測(cè)序檢測(cè)microRNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。去甲基化藥物處理MLL-AF4陽性急性白血病細(xì)胞系RS4；11及MV4-11，進(jìn)一步探究表觀遺傳學(xué)調(diào)控MLL-AF4表達(dá)的機(jī)制。
　　 結(jié)果：成熟miR-143表達(dá)載體可以明顯下調(diào)MLL-AF4基因3’UTR表達(dá)載體的熒光素酶活性，提示miR-143可以

5、調(diào)控MLL-AF4融合基因。突變體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-143通過靶向結(jié)合MLL-AF4融合基因的3’UTR調(diào)控MLL-AF4融合基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western Blot證實(shí)miR-143異常高表達(dá)后MLL-AF4融合基因mRNA及蛋白水平明顯下調(diào)。MLL-AF4陽性急性白血病細(xì)胞系RS4；11及MV4-11中異常高表達(dá)miR-143，可以抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。qRT-PCR檢測(cè)健康人、白血病細(xì)胞系及原代白血病細(xì)胞

6、中miR-143表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MLL-AF4陽性急性淋巴細(xì)胞白血病中miR-143表達(dá)出現(xiàn)特異性下調(diào)，明顯低于健康人及不攜帶MLL-AF4融合基因的其他類型白血病。硫化測(cè)序表明在MLL-AF4陽性急性白血病中，miR-143啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)異常高甲基化。去甲基化藥物處理MLL-AF4陽性急性細(xì)胞白血病細(xì)胞系后，細(xì)胞明顯凋亡，同時(shí)miR-143表達(dá)上調(diào)，加用miR-143抑制劑后可以部分逆轉(zhuǎn)去甲基化藥物引起的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：人