甲基化-microRNA-MLL-AF4融合蛋白調控通路參與急性淋巴細胞白血病發(fā)生發(fā)展的機理研究.pdf

1、目的：MLL(mixed lineage leukemia)基因異常是急性白血病中一種非常常見的染色體異常，大多數(shù)發(fā)生MLL基因異常的急性白血病預后很差，是血液病研究領域的熱點。MLL-AF4陽性的急性淋巴細胞白血病是成人急淋中是僅次于費城染色體的第二大常見染色體異常，出現(xiàn)t(4；11)(q21；q23)易位，形成MLL-AF4融合基因，多數(shù)患者對常規(guī)化療耐藥，即使行異基因造血干細胞移植也容易復發(fā)，是一個獨立的預后不良因素。目前其發(fā)病機

2、理不清，也缺乏有效的靶向治療措施，亟需從分子機制揭示致病機理。本研究旨在探討MLL-AF4陽性急性淋巴細胞白血病中，MLL-AF4原癌基因與調控MLL-AF4的miR-143共同作用，參與MLL-AF4陽性白血病發(fā)生發(fā)展的機理。為難治復發(fā)型白血病提供新的治療靶點，并為去甲基化藥物治療MLL-AF4陽性急性淋巴細胞白血病奠定理論基礎。
　　 材料與方法：利用microRNA靶標反向篩選法篩選可以調控MLL-AF4融合基因的micr

3、oRNA，突變體實驗進一步證實microRNA通過靶向結合MLL-AF4融合基因的3’UTR(Untranslated Regions)調控MLL-AF4融合基因。實時定量RT-PCR及Western Blot觀察microRNA異常高表達后MLL-AF4融合基因mRNA及蛋白水平變化。MLL-AF4陽性急性白血病細胞系RS4；11及MV4-11中，轉染microRNA，觀察對MLL-AF4下游靶基因、白血病細胞凋亡、生長曲線、細胞周期

4、及細胞分化等的影響。實時定量RT-PCR檢測MLL-AF4陽性急性淋巴白血病細胞系及其他白血病細胞系中microRNA的表達情況，硫化測序檢測microRNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。去甲基化藥物處理MLL-AF4陽性急性白血病細胞系RS4；11及MV4-11，進一步探究表觀遺傳學調控MLL-AF4表達的機制。
　　 結果：成熟miR-143表達載體可以明顯下調MLL-AF4基因3’UTR表達載體的熒光素酶活性，提示miR-143可以

5、調控MLL-AF4融合基因。突變體實驗進一步證實miR-143通過靶向結合MLL-AF4融合基因的3’UTR調控MLL-AF4融合基因表達。實時定量RT-PCR及Western Blot證實miR-143異常高表達后MLL-AF4融合基因mRNA及蛋白水平明顯下調。MLL-AF4陽性急性白血病細胞系RS4；11及MV4-11中異常高表達miR-143，可以抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。qRT-PCR檢測健康人、白血病細胞系及原代白血病細胞

6、中miR-143表達情況，發(fā)現(xiàn)MLL-AF4陽性急性淋巴細胞白血病中miR-143表達出現(xiàn)特異性下調，明顯低于健康人及不攜帶MLL-AF4融合基因的其他類型白血病。硫化測序表明在MLL-AF4陽性急性白血病中，miR-143啟動子區(qū)出現(xiàn)異常高甲基化。去甲基化藥物處理MLL-AF4陽性急性細胞白血病細胞系后，細胞明顯凋亡，同時miR-143表達上調，加用miR-143抑制劑后可以部分逆轉去甲基化藥物引起的細胞凋亡。
　　 結論：人