人小腸黏膜潘氏細胞形態(tài)學(xué)和功能作用研究.pdf

1、研究目的:1、觀察并比較人小腸各段潘氏細胞的分布，形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。分析與其功能之間的關(guān)系。 2、通過透射電子顯微鏡展示處于不同分泌時相的人小腸潘氏細胞的超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特點。 3、觀察并分析潘氏細胞脫顆粒與小腸黏膜上皮細胞增殖狀態(tài)之間的關(guān)系。實驗方法 一、材料和方法:1、1實驗標本選取及分組：取自中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院2005年3月至2005年10月間，胃腸胰外科病人手術(shù)切除的小腸標本共24例，其中包括十二指腸8例，

2、空腸8例，回腸8例。8例十二指腸標本及8例空腸標本來源于5位男性(平均年齡51.8±8.0歲)，3位女性(平均年齡53.6±11.0歲)，病種包括胃、十二指腸腸良性潰瘍4例，早期胃癌4例，均行畢Ⅱ式胃-空腸吻合，分別取十二指腸殘端及距離Tris韌帶15-20cm處的空腸黏膜一小塊。8例回腸標本來源于6位男性(平均年齡55.6±12.0歲)，2位女性(分別61，53歲)，手術(shù)病種包括升結(jié)腸癌4例，升結(jié)腸多發(fā)性憩室1例，均行右半結(jié)腸切除術(shù)；

3、因直腸癌行預(yù)防性回腸造口后，回腸末端關(guān)瘺術(shù)3例；分別取距離回盲部10-15cm的末端回腸或回腸造瘺口近端黏膜各一小塊.所有標本經(jīng)病理學(xué)檢查證實為正常小腸黏膜組織.三組患者在年齡和性別分布、疾病構(gòu)成，分期及有無其它共患病等方面差異無顯著性。排除激素，免疫抑制劑等藥物及炎癥性腸病等疾病因素的影響，所有患者術(shù)前未接受過放療、化療及抗生素治療。 1、2標本處理標本切除后立即投入液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍保存直至使用。取所存標本經(jīng)冷

4、生理鹽水漂洗5分鐘后，10％中性福爾馬林溶液固定24小時以上，脫水，然后行常規(guī)石蠟包埋。制成3-5um石蠟切片后，蘇木素—伊紅(HE)染色，行常規(guī)病理組織學(xué)檢查和增殖細胞核抗原(PCNA)、溶菌酶(Lysozyme)免疫組化染色檢測。 1、3人小腸黏膜潘氏細胞(PCs)及人回腸上皮增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組化染色人小腸黏膜潘氏細胞(PCs)染色采用溶菌酶免疫組化染色方法。免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。石蠟包

5、埋的組織塊在切片機上行3～5μm切片；常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化：磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次5分鐘(下同)；微波熱修復(fù)抗原30分鐘，每張切片加50ul過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗3次；加50ul的正常非免疫動物血清，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗；加50ul的Lysozyme多克隆抗體或PCNA單抗，4℃下孵育過夜；PBS洗3次；加50ul生物素標記的第二抗體(試劑C，黃色液體)，室溫下孵育30分

6、鐘；PBS洗3次；加50ul鏈霉素抗生物素-過氧化酶溶液，室溫下孵育30分鐘；PBS洗3次；每張切片100ul新鮮配制的DAB溶液，顯色3-10分鐘；自來水充分沖洗10分鐘；蘇木素復(fù)染2分鐘；PBS或自來水沖洗返藍；梯度酒精脫水干燥；透明；中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對照，以淋巴瘤組織作為PCNA陽性對照。 1、4人小腸潘氏細胞計數(shù)及回腸黏膜上皮細胞PCNA增殖指數(shù)檢測在普通光鏡下觀察十二指腸，空腸，回腸PCs的形態(tài)、

7、結(jié)構(gòu)特點、分泌顆粒的染色情況及分段細胞記數(shù)； 溶菌酶陽性的潘氏細胞計數(shù)(x±s)：10×40視野下觀察，按確定的方向依次計數(shù)10個結(jié)構(gòu)顯示良好，染色清晰的隱窩腔，計算其中LZM染色陽性PCs數(shù)量，總數(shù)即為每10個隱窩LZM染色陽性的PCs數(shù)，每組大鼠可得8個數(shù)值。，計量資料以x±SD表示。 細胞核著棕黃色判定為PCNA陽性染色細胞，每張回腸PCNA染色切片隨機選擇5個高倍視野，每個視野選擇3條絨毛，計數(shù)每條絨毛中陽性細胞

8、數(shù)和總細胞數(shù)，PCNA指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％。 1、5人小腸潘氏細胞顆粒分泌狀態(tài)分析采用KontronIBAS2.0全自動圖像分析系統(tǒng)，在40×10倍視野下觀察，每張回腸潘氏細胞Lysozyme免疫組化切片隨機選取5個視野，測算每一測試區(qū)域的灰度級GA和面積(m+n)、陽性反應(yīng)產(chǎn)物的灰度級Gα和面積n(或背景面積m)。測試儀器最大灰度分級(Gmax)為256。應(yīng)用免疫組織化學(xué)定量計算公式：PU=100×|Ga-GA

9、|/Gmax×[1-(n/m+n)]，導(dǎo)出陽性單位(PU)數(shù)值，每張切片均可得出一平均PU值，其數(shù)值大小即可說明潘氏細胞顆粒含量的多少。并進一步分析潘氏細胞的顆粒分泌狀態(tài)與小腸黏膜上皮細胞增殖之間的關(guān)系。 1、6透射電鏡下人回腸潘氏細胞超微結(jié)構(gòu)特點另取回腸1mm×1mm×2mm大小的組織塊置2.5％戊二醛中固定，透射電鏡下觀察不同分泌時期PCs超微結(jié)構(gòu)特征。 二、檢測指標：1、光鏡下觀察人小腸各段潘氏細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及

10、分布。 2、透視電鏡下觀察不同狀態(tài)下人潘氏細胞的超微結(jié)構(gòu)特征。 3、人回腸黏膜上皮細胞PCNA增殖指數(shù)的檢測。 4、圖像分析系統(tǒng)對潘氏細胞顆粒進行定量分析，并分析潘氏細胞脫顆粒與小腸黏膜上皮細胞的增殖及多能干細胞之間的關(guān)系。 三、統(tǒng)計學(xué)處理：計量資料采用t檢驗，多組的PCs計數(shù)采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)檢驗；P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差

11、異有明顯顯著性。上述檢驗均采用SAS8.1版本統(tǒng)計軟件包在電腦上運行。 結(jié)論:1、在一般情況下，人小腸潘氏細胞僅存在于小腸，由十二指腸向下至空腸，回腸，細胞數(shù)量呈遞增分布。人結(jié)腸中未見有潘氏細胞。 2、人潘氏細胞位于小腸黏膜隱窩的基底部，呈簇狀分布，細胞形態(tài)為錐形柱狀，細胞核位于細胞基底部，其胞質(zhì)中含有一定數(shù)量的分泌顆粒，分泌顆粒溶菌酶染色為陽性。 3、透射電鏡下見人小腸潘氏細胞具有腸內(nèi)分泌細胞超微結(jié)構(gòu)特征。處于

12、分泌期的潘氏細胞細胞器結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張和發(fā)達的高爾基體，線粒體明顯腫脹，脫顆粒后潘氏細胞核上胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡樣變。但細胞核沒有顯示凋亡改變，潘氏細胞脫顆粒是一主動過程，顆粒分泌與否并不是由于細胞的凋亡引起。 4、人潘氏細胞顆粒分泌與小腸黏膜細胞的增殖狀態(tài)有關(guān)，反映在潘氏細胞脫顆粒時，其小腸黏膜增殖細胞核抗原(PCNA)指數(shù)增高。PCNA指數(shù)在一定程度上可以反應(yīng)腸上皮干細胞的增殖狀態(tài)，檢測PCNA指數(shù)變化即反應(yīng)腸黏膜上皮損