先天性巨細胞病毒感染致腦發(fā)育異常及其機制研究.pdf

1、[研究背景] 人巨細胞病毒(HCMV)是導致胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損害的首要病因，嚴重影響兒童生存質量，揭示其神經(jīng)損傷機制，對防治策略的制定和全面提高人口素質具有重大社會和經(jīng)濟意義。但其發(fā)病機制研究成效甚微，原因在于：①巨細胞病毒(CMV)具嚴格種屬特異性，不能建立HCMV感染的動物模型；②CMV是最大的DNA病毒和蛋白嵌合體，其基因動態(tài)表達，蛋白種類多、功能復雜；③CMV宮內感染致腦發(fā)育異常與發(fā)育階段性密切相關，如何在動態(tài)

2、發(fā)育的過程中抓住關鍵時空進行研究也是難點問題。 CMV感染所致CNS損傷主要見于胎兒期，既往認為胎兒免疫系統(tǒng)不成熟，不能保護腦組織免受感染是其主要原因。但近年研究發(fā)現(xiàn)，CMV對發(fā)育中的腦組織有特殊親嗜性，這與細胞的內在原因有關。因此，CMV感染所致CNS損傷是一種與腦發(fā)育有關的疾病，必須在CNS動態(tài)發(fā)育過程中研究其發(fā)病機制。 [目的] 建立適合整體水平研究CMV先天感染的小鼠模型，觀察病毒對不同發(fā)育階段胎腦發(fā)育的

3、影響及其CNS損傷的病理特點。進一步利用神經(jīng)干細胞(NSCs)和胚胎干細胞(EScells)向神經(jīng)細胞分化的細胞模型，在體外模擬神經(jīng)細胞發(fā)育過程，在細胞和分子水平上動態(tài)研究CMV對ES、NSCs及不同發(fā)育階段神經(jīng)細胞功能和發(fā)育的影響，并探討其中可能涉及的分子機制，為闡明CMV感染致腦發(fā)育異常機制奠定實驗和理論基礎，為尋找有效防治措施提供新策略。 [方法] 1MCMV先天感染小鼠模型建立與整體研究 在BALB/c孕

4、鼠孕8d(E8d，孕中期，神經(jīng)管開始形成)和孕13.5d(E13.5d，孕中后期，神經(jīng)元形成高峰期)，采用宮內注射法接種含有LacZ報告基因的MCMV重組毒株RM461(104PFU、103PFU和102PFU)，并以同期注射DMEM細胞培養(yǎng)基的孕鼠作為對照。于E18.5d剖宮取出胎鼠，通過X-gal染色和組織切片分析，觀察MCMV接種時妊娠階段和病毒載量對妊娠結局、胎鼠CNS發(fā)育和病理損傷特點的影響。 2MCMV對神經(jīng)干細胞分

5、化發(fā)育細胞模型的影響 從E13.5d胎鼠腦組織中分離、培養(yǎng)和鑒定NSCs，建立NSCs向神經(jīng)細胞分化發(fā)育的細胞模型；在MCMVRM461感染后，用X-gal染色監(jiān)測感染過程，透射電鏡觀察超微結構改變和病毒顆粒，PCR檢測受染細胞和培養(yǎng)上清中病毒DNA，并結合觀察培養(yǎng)上清接種到小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的細胞病變效應共同評估NSCs對MCMV的易感性和感染狀態(tài)；采用細胞生長曲線和MTT實驗，觀察MCMV對NSCs增殖的影響；采用

6、細胞免疫化學和流式細胞術分析Nestin、GFAP、NSE和NF-200表達，探討MCMV對NSCs分化的影響；采用FITC-AnnexinV+PI染色和流式細胞術分析病毒對NSCs凋亡的影響；采用Westernblot聯(lián)合RT-PCR法檢測MCMV對NSCs分化相關基因Wnt-1和Ngn1表達的影響。 3MCMV對胚胎干細胞定向分化發(fā)育細胞模型的影響 以小鼠ES細胞系D3為研究對象，在4-/4+方案誘導ES細胞定向生成

7、神經(jīng)元的基礎上，利用ATRA聯(lián)合星形膠質細胞高效誘導ES細胞定向生成神經(jīng)干/前體細胞和神經(jīng)元；通過形態(tài)學觀察、畸胎瘤形成實驗、堿性磷酸酶染色、RT-PCR檢測胚胎干細胞標志Oct-4表達對ES細胞的全能性進行鑒定；用免疫組織化學結合流式細胞術檢測ES細胞來源的NSCs的數(shù)量和純度；用分化實驗對所誘導的NSCs的分化潛能進行檢測；最后利用ES細胞向神經(jīng)細胞分化的細胞模型探討MCMV對ES細胞及ES細胞向神經(jīng)細胞分化的影響。 [結果

8、] 1MCMV先天感染模型建立與整體研究 1)用宮內注射法成功建立MCMV先天感染小鼠模型：高病毒載量宮內感染極易導致死胎和吸收胎，僅少數(shù)胎鼠存活(5.9％)；低病毒載量感染組存活率明顯提高(47.1％)，但腦組織病毒陽性率隨之下降(12.5％)。103PFU為建立MCMV先天感染模型的合適劑量，其存活率和腦組織病毒陽性率分別為27.8％和80％。2)采用103PFU病毒載量，E8d宮內注射MCMV組胎鼠的存活率(26.

9、9％)和體重顯著低于同期DMEM對照組，而吸收胎率(55.8％)高于對照組；E13.5d宮內注射MCMV組胎鼠存活率(52.0％)低于同期DMEM對照組，而吸收胎率(14.0％)與對照組無明顯差異。E8d與E13.5d病毒注射組相比，前者存活率低于后者，而吸收胎率高于后者，且發(fā)現(xiàn)小頭畸形鼠3例。 3)MCMV感染胎鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎等組織X-gal染色呈陽性反應，并且均可分離到病毒，說明該模型是一種全身播散型感染。腦組織

10、X-gal染色顯示陽性細胞主要位于腦室管膜下區(qū)、海馬區(qū)和大腦皮層的外周部分。 2MCMV對神經(jīng)干細胞分化發(fā)育的影響 1)體外培養(yǎng)的NSCs可在體外連續(xù)傳代，仍保持球形生長的能力，nestin表達強陽性，可進一步分化NSE、NF-200陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星形膠質細胞。 2)MCMV感染NSCs可形成產(chǎn)毒性感染：在感染48h后，細胞出現(xiàn)腫脹，體積增大，神經(jīng)球邊緣的細胞發(fā)生脫落和死亡，細胞形態(tài)改變隨病毒感染復

11、數(shù)(MOI)的增加而更加明顯；X-gal染色顯示，24h受染細胞即可出現(xiàn)陽性改變，48h達高峰；病毒感染72h時，受染細胞及培養(yǎng)上清中MCMVDNA呈陽性，培養(yǎng)上清接種到小鼠MEF細胞后可出現(xiàn)明顯細胞病變；電鏡下受染細胞胞漿中存在病毒顆粒，細胞器腫脹明顯。 3)MCMV可明顯抑制NSCs的增殖，抑制作用隨MOI增加而增強。 4)MCMV可明顯抑制NSCs的分化：流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，NSCs分化培養(yǎng)2d時感染組和未感染組n

12、estin陽性細胞分別為(62.2±1.8)％和(37.2±2.4)％，差異有極顯著性(P＜0.01)；而GFAP陽性細胞比率分別為(37.4±1.6)％和(50.3±1.8)％，NSE陽性細胞比率分別為(8.9±0.8)％和(23.4±1.3)％，差異均有極顯著性(P＜0.01)。 5)MCMV對NSCs細胞凋亡的影響：MCMV感染組與對照組的早期凋亡率和晚期凋亡率均無明顯差異。但感染組細胞死亡率自感染48h始上升，明顯高于對

13、照組，至第5d可達(15.2±3.8)％，顯著高于對照組的(5.1±0.3)％。 6)MCMV感染可抑制Wnt-1和Ngn1的表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，感染組Wnt-1基因表達量在12h，24h，48h時低于對照組(P＜0.01)，Ngn1基因表達量在12h，24h，48h，72h時均低于對照組(P＜0.01)；Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，感染組Wnt-1蛋白表達量在24h，48h時低于對照組(P＜0.01)。 3

14、MCMV對胚胎干細胞定向分化發(fā)育的影響 1)體外培養(yǎng)的小鼠ES細胞-D3在胚胎成纖維飼養(yǎng)層細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，仍保持向三胚層分化的能力，在免疫缺陷鼠體內可形成畸胎瘤；ES細胞AKP染色和Oct-4表達陽性。 2)ATRA可促進ES細胞向神經(jīng)元方向分化：采用4-/4+方案誘導分化的NF-200陽性細胞為(27.3±1.2)％，而未加ATRA對照組(4-/4-)僅為(2.1±0.4)％(P＜0.01)。 3)2-/2

15、+ATRA聯(lián)合星形膠質細胞(基質誘導細胞)可高效誘導ES細胞分化為神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元，最終可誘導形成純度高達91.4％的nestin陽性細胞；nestin陽性細胞在含血清培養(yǎng)基中可進一步分化為神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質細胞和少突膠質細胞，聯(lián)合誘導組NF-200和NSE陽性率為(42.7±2.6)％，而2-/2+/4-ATRA對照組陽性率僅為(11.2±1.8)％(P＜0.01)。 4)MCMV感染未分化的ES細胞不能形成產(chǎn)毒性感染，

16、但分化的ES細胞可形成產(chǎn)毒性感染；MCMV感染不影響未分化ES細胞的增殖。 5)MCMV感染可抑制ES細胞來源的神經(jīng)元形成，感染組NF-200陽性細胞為(10.2±0.3)％，顯著低于對照組的(29.3±0.8)％(P＜0.01)。 [結論] 1.成功建立了先天性MCMV感染的小鼠模型與NSCs和ES細胞向神經(jīng)細胞分化的細胞模型，為體內、外探討CMV先天感染致腦發(fā)育機制提供了較為切實可行的、理想的細胞和整體研究模

17、型。 2.MCMV先天感染可導致明顯的腦發(fā)育異常；MCMV對妊娠結局的影響與病毒載量、感染的妊娠階段有關，小鼠妊娠中期對MCMV的敏感性要高于晚期。 3.MCMV可感染體外培養(yǎng)的NSCs，并能形成產(chǎn)毒性感染；MCMV可明顯抑制NSCs的增殖、分化并可導致NSCs死亡；MCMV可通過抑制Wnt-1和Ngn1基因表達而影響NSCs分化；MCMV抑制NSCs的增殖與分化可能與先天性CMV感染致腦發(fā)育異常有關。 4.星形