G-CSF動(dòng)員后外周血干細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)皮前體細(xì)胞以及治療糖尿病足的研究.pdf

1、研究目的：1建立成人外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)的方法，以及其在抗原表達(dá)方面的生物學(xué)特性。 2探討人重組粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)動(dòng)員后外周血干細(xì)胞對(duì)糖尿病足綜合征的療效，對(duì)重癥高位動(dòng)脈閉塞下肢血管充盈改善及新增側(cè)枝循環(huán)的情況，同時(shí)初步評(píng)價(jià)該方法對(duì)下肢周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)作用。 3探討自體外周血干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病足患者血漿血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1

2、)水平的影響 研究方法：1采用密度梯度離心的方法處理rhG-CSF動(dòng)員后的單采標(biāo)本獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)，在纖維連接素(FN)包備后EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，通過(guò)免疫表型、活性免疫熒光染色及組織化學(xué)染色法鑒定EPCs。 2應(yīng)用rhG-CSF(600μg/day)動(dòng)員第5天以CS3000plus血細(xì)胞分離機(jī)采集干細(xì)胞懸液約50ml，配制成1×108/ml的細(xì)胞懸液后，注入患病下肢。注射方法為每間隔3×3cm

3、2注射一針，每針注射0.8～1.0ml，注射范圍如僅脛前動(dòng)脈閉塞行雙腓腸肌注射，如同時(shí)伴股淺動(dòng)脈閉塞則雙腓腸肌及股三、股四頭肌同時(shí)注射。于注射前及注射后3個(gè)月分別評(píng)價(jià)患者癥狀體征、外周血管彩色多譜勒血流顯像、數(shù)字剪影及神經(jīng)肌肉電生理檢測(cè)結(jié)果。 3應(yīng)用ELISA法檢測(cè)患者動(dòng)員前、動(dòng)員結(jié)束當(dāng)天、干細(xì)胞移植后2個(gè)月及正常對(duì)照者血漿VEGF及TGF-β1水平。 研究結(jié)果：1rhG-CSF動(dòng)員后應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)采集PBMNCs中含

4、CD45low+CD34+細(xì)胞在0.7(0.33～1.0)％，而其中CD133+細(xì)胞占CD34+細(xì)胞比例中位數(shù)8.52(0.89～19.62)％，CD14+細(xì)胞比例中位數(shù)為19.56(9.61～30.54)％，CD31+細(xì)胞占CD14+細(xì)胞比例中位數(shù)為86.59(71.25～94.41)％。經(jīng)FN包備后EGM-2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)4～6天后有小的細(xì)胞集落形成，4～5天左右可見(jiàn)梭形細(xì)胞出現(xiàn)，培養(yǎng)2周后鑒定DiI-acLDL、UEA-1-FIT

5、C、vWF、VEGF-2(KDR)、CD44，CD105，CD45，CD34及CD14陽(yáng)性，CD62陰性，具有內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及表型特征。2共13例患者移植后3個(gè)月評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，患者下肢冷感、疼痛及間歇性跛行明顯改善。治療后踝肱比(ABI)明顯提高，從治療前的0.37±0.16提高到治療后的0.53±0.22，(p=0.002＜0.005)。脛前動(dòng)脈側(cè)枝數(shù)顯著增加，治療前平均側(cè)枝數(shù)為0.69±2.02，治療后側(cè)枝形成數(shù)為3.5±2.3

6、4，(p=0.001＜0.005)，動(dòng)脈流速增加，治療前為7.59±15.26cm/s治療后為28.94±28.60cm/s，(p=0.002＜0.005)，充盈程度較治療前明顯增加治療前為0.94±0.97治療后為1.94±0.83，(p＜0.001)。神經(jīng)肌肉電生理檢測(cè)顯示，脛運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的動(dòng)作電位潛伏期縮短，脛感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅均較治療前明顯增加(均p＜0.05)。雖然移植后腓感覺(jué)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度及波幅也有增加，但無(wú)顯著性差異。13

7、例患者中10例癥狀明顯好轉(zhuǎn)，3例無(wú)明顯好轉(zhuǎn)總有效率80％。 3糖尿病足患者rhG-CSF動(dòng)員前血漿VEGF濃度為180.207±242.067(pg/ml)，TGF-β1濃度為41.730±87.470(pg/ml)，動(dòng)員后分別為151.378±134.552(pg/ml)及17.453±16.313(pg/ml)，與動(dòng)員前相比無(wú)顯著性差別(p=1及p=0.293)。但與正常健康體檢老人VEGF濃度為28.395±23.554(

8、pg/ml)及TGF-β1濃度為9.484±6.728(pg/ml)相比，患者動(dòng)員前VEGF及TGF-β1水平均顯著增高(p=0.015＜0.05及p=0.040＜0.05)。移植后2個(gè)月血漿VEGF濃度為215.080±183.300(pg/ml)，血漿TGF-β1濃度為20.310±13.224(pg/ml)，與動(dòng)員前相比亦無(wú)顯著性差別(p=0.241及p=0.799)。 研究結(jié)論：1經(jīng)rhG-CSF動(dòng)員后應(yīng)用血細(xì)胞分離機(jī)采

9、集PBMNCs中含有較高比例的CD34+及CD14+細(xì)胞，應(yīng)用EGM-2培養(yǎng)基于FN包備過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)皿中體外培養(yǎng)2周后，所獲得細(xì)胞均具有EPCs特性，這些細(xì)胞既有內(nèi)皮細(xì)胞的表型，同時(shí)擁有造血細(xì)胞的表型，證明經(jīng)rhG-CSF動(dòng)員后外周血是PCs有效來(lái)源。 2rhG-CSF動(dòng)員后采集PBMNCs注入既可以改善糖尿病足患者下肢供血，增加閉塞動(dòng)脈的側(cè)枝循環(huán)形成，同時(shí)又可以修復(fù)下肢神經(jīng)的損傷，改善患者足部感覺(jué)，提高自身保護(hù)能力，是治療糖尿病