Cry9Aa和VipAa蛋白對水稻二話螟毒理的協(xié)同增效機(jī)理研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt），是一種革蘭氏陽性菌，能夠在芽胞期產(chǎn)生伴胞晶體蛋白。由于其具有對非靶標(biāo)害蟲無毒無害、對環(huán)境安全等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于雙翅目、鱗翅目和鞘翅目害蟲的防治。隨著轉(zhuǎn)Bt作物的大面積種植，害蟲的抗性問題日益嚴(yán)重，蛋白之間的協(xié)同增效有助于此問題的解決。本論文圍繞Cry9Aa蛋白的可溶性改造、最小活性區(qū)、純化最優(yōu)條件的篩選、寡聚化的影響、Cry9Aa蛋白和Vip3Aa蛋白N端酶切斷裂

2、點(diǎn)分析，以及它們之間的增效機(jī)理等方面進(jìn)行了研究。
　　cry9Aa3基因，是本實(shí)驗(yàn)室克隆，對多種鱗翅目害蟲有較高活性，Cry9Aa蛋白在Bt無晶體突變體中不表達(dá)，而在大腸桿菌中主要是以包涵體的形式存在，上清中表達(dá)量極低。本研究通過兩個(gè)途徑對該蛋白進(jìn)行了改造：（一）通過 BP和RecA重組將Cry9Aa的核心區(qū)和Cry1Ac的C末端所對應(yīng)的基因片段融合，構(gòu)建融合基因 cry9AaAc，轉(zhuǎn)入 HD73無晶體突變株，鏡檢陽性克隆菌株，無

3、晶體產(chǎn)生，SDS-PAGE分析菌株總蛋白，未檢測到目標(biāo)蛋白；（二）根據(jù)Cry9Aa蛋白信息學(xué)分析結(jié)果設(shè)計(jì)了11個(gè)截短位點(diǎn)，SDS-PAGE分析各截短蛋白上清表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Cry9Aa3-1～654、Cry9Aa3-1～655蛋白上清表達(dá)量顯著提高。
　　通過Cry9Aa各截短蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的活性分析，發(fā)現(xiàn)Cry9Aa對小菜蛾和亞洲亞洲玉米螟的最小活性區(qū)相同，均位于45I和654V之間。
　　通過研究Binding b

4、uffer中咪唑和NaCl濃度對Cry9Aa蛋白純化的影響，最終篩選出咪唑濃度為50 mmol/L，NaCl濃度為500 mmol/L為最優(yōu)純化條件。通過研究不同pH值、NaCl濃度與Cry9Aa蛋白寡聚化之間的關(guān)系，明確了高pH值和NaCl濃度能夠抑制該蛋白的寡聚化，通過研究DTT對寡聚化的影響，確定了該蛋白的寡聚化是由分子間二硫鍵介導(dǎo)的，從而篩選出此蛋白單體穩(wěn)定存在的條件是緩沖液必須有1 mmol/L的DTT存在。
　　通過C

5、ry9Aa和Vip3Aa蛋白對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和水稻二化螟的中腸液的消化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cry9Aa蛋白消化后有約60 kDa片段產(chǎn)生，Vip3Aa蛋白有約62 kDa片段產(chǎn)生。通過N端測序和質(zhì)譜技術(shù)，得出Cry9Aa蛋白的酶切片段的N端斷裂點(diǎn)位于23K與24Y之間，Vip3Aa蛋白的酶切片段的N端斷裂點(diǎn)位于39K與40T之間。
　　通過兩種蛋白對水稻二化螟的生測，驗(yàn)證了純化的Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的組合對水稻二化螟的增效