灌腸方抑制腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為以及與化療藥物協(xié)同增效的機理研究.pdf

1、背景與目的:
　　結(jié)腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類生命和健康的惡性腫瘤。我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，位居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第四位。如何有效的預(yù)防和治療結(jié)腸癌，成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點問題。除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療與化療外，進(jìn)一步開發(fā)、尋找高效、低毒的藥物和中西醫(yī)結(jié)合治療方案，仍是目前結(jié)腸癌治療中有待解決的關(guān)鍵。天然藥物因其多靶點、多環(huán)節(jié)和多途徑的抗腫瘤作用，以及低毒，低副作用的特點，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點。本研究的灌腸方，是從中

2、藥仙鶴草、敗醬草、龍葵中提取出來的復(fù)方提取物，藥理作用廣泛，抗癌是其主要作用之一。氟尿嘧啶是治療結(jié)腸癌的主要抗癌藥物，具有廣泛的抗腫瘤譜。因此，在深入研究灌腸方提取物的抗癌活性與作用機制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其與氟尿嘧啶聯(lián)合的抗結(jié)腸癌作用，可為結(jié)腸癌中西醫(yī)結(jié)合綜合治療的臨床應(yīng)用，提供有價值的實驗理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定灌腸方總提物成分;MTT法檢測不同濃度灌腸方醇提液對人腸癌LoVo細(xì)胞的增殖

3、抑制率;流式細(xì)胞術(shù)檢測灌腸方醇提液對LoVo細(xì)胞凋亡的影響;transwell小室、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞劃痕實驗檢測灌腸方醇提液對LoVo細(xì)胞侵襲，粘附，遷移的影響;RT-PCR檢測灌腸方醇提液對LoVo細(xì)胞Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)分子(Raf，MEK1/2，ERK1/2)和Bax，Bcl-2，NF-κ BmRNA的表達(dá);Western blot法檢測灌腸方醇提液對LoVo細(xì)胞Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)分

4、子(Raf, P-Raf, MEK1/2，P-MEK1/2，ERK1/2, P-ERK1/2)和Bax, Bcl-2, procaspase-9, procaspase-3, NF-κB蛋白表達(dá)的變化;根據(jù)荷腸癌LoVo細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積和重量計算灌腸方提取液的抑瘤率;HE染色光鏡觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)法檢測灌腸方提取物對腫瘤組織Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)分子蛋白的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst實驗

5、、RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)研究了灌腸復(fù)方聯(lián)合氟尿嘧啶的體內(nèi)外抗結(jié)腸癌作用及相關(guān)機制。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　結(jié)果:
　　1、灌腸方提取液主要的化學(xué)成分為:兒茶素、花旗松素、槲皮苷、鞣花酸、槲皮素、木犀草素、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿、澳洲茄胺9種成分，在醇提物中7種成分高于水提物。提示醇提液的成分明顯高于水提液。
　　2、灌腸方醇提液可抑制LoVo細(xì)胞的增殖活性并具有明顯劑量和時間依賴性。在處理細(xì)胞24、48

6、和72h，灌腸方對LoVo細(xì)胞的IC50分別為:5.67±0.21 mg/mL，3.49±0.23mg/mL,1.74±0.04 mg/ml。
　　3、7mg/mL灌腸方醇提液干預(yù)LoVo細(xì)胞48h后RT-PCR結(jié)果提示Raf、MEK1/2、ERK1/2、Bcl-2、NF-κB mRNA表達(dá)明顯降低，而BaxmRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，Westernblot結(jié)果提示p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bcl-

7、2、NF-κ B、procaspase-9，procaspase-3蛋白表達(dá)降低，而Bax蛋白表達(dá)增加，同樣具有明顯的劑量依賴性。
　　4、7mg/ml、0.87mg/ml、0.21mg/ml濃度灌腸方作用LoVo細(xì)胞48h有明顯的抑制侵襲粘附轉(zhuǎn)移作用，3種濃度對LoVo細(xì)胞的侵襲抑制率分別為83.76％、58.18％、31.76％(P＜0.01)
　　5、灌腸方對LoVo細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤HE染色顯示:空白對照組，癌細(xì)胞較

8、大，胞漿豐富，可見大量的核分裂，大量炎細(xì)胞浸潤;實驗組隨著灌腸方劑量的增加，核分裂、炎癥細(xì)胞浸潤逐漸減少，并可見凋亡/壞死。大、中、小劑量組的灌腸方提取液抑瘤率分別為:65.85％、39.9％、24.47％。免疫組化顯示灌腸方組P-MEK1/2，Cox-2、VEGF、procaspase-9、procaspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)增加，且隨著劑量的增高，作用逐漸增強。
　　6、在協(xié)同實驗中

9、發(fā)現(xiàn)，灌腸方能抑制LoVo細(xì)胞增殖，使LoVo細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，灌腸方可在mRNA水平上調(diào)氟尿嘧啶療效相關(guān)基因OPRT的表達(dá)，下調(diào)TS、DPD基因表達(dá)水平，從而協(xié)同5-Fu誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　7、裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，灌腸方能抑制LoVo細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，且與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對移植瘤生長抑制產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，單藥氟尿嘧啶、灌腸方以及聯(lián)合用藥腫瘤抑瘤率分別為42.7％、37.52％、67.33％(P＜0.05)。
　

10、　總之，灌腸方可以通過細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)凋亡作用使腫瘤細(xì)胞生長停滯并逐漸走向死亡，與氟尿嘧啶聯(lián)用對LoVo細(xì)胞生長具有協(xié)同抑制效應(yīng)。灌腸方與氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療，增加了抗癌作用，并且未出現(xiàn)兩藥毒性重疊現(xiàn)象，提示灌腸方與氟尿嘧啶聯(lián)合治療結(jié)腸癌具有可行性，值得在臨床推廣應(yīng)用。
　　結(jié)論:
　　1、灌腸方提取液可從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)兩個層面調(diào)控Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個分子的表

11、達(dá)，從而發(fā)揮其抑制LoVo細(xì)胞的增殖，侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2、灌腸方提取液能在RT-PCR水平上調(diào)氟尿嘧啶療效相關(guān)基因OPRT的表達(dá)，下調(diào)TS、DPD基因表達(dá)，協(xié)同5-Fu，發(fā)揮抑制LoVo裸鼠移植瘤的生長作用。
　　3、灌腸方是一種安全的、有潛力的可以治療惡性腫瘤的經(jīng)典方劑，值得進(jìn)行深入研究。
　　本實驗擬通過中藥復(fù)方灌腸方對LoVo細(xì)胞的研究，渴望在中醫(yī)藥抗腫瘤領(lǐng)域有所突破。因此，本實驗通過從整體動物、細(xì)