負性共刺激分子在慢性乙肝患者外周血Treg的表達特性及其臨床意義.pdf

1、由乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染導致的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）為世界范圍內的傳染性疾病，與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。HBV感染誘發(fā)機體產生以細胞毒性T細胞（cytotoxict lymphocyte，CTL）特異性免疫應答為主的多種抗病毒免疫反應。當病毒不能有效清除而持續(xù)復制，將會導致HBV感染慢性化，發(fā)展為慢性乙型肝炎，其主要原因可能是HBV特異性CTL的免疫

2、應答減弱。CTL的免疫功能缺失與抑制性受體分子的上調表達、抑制性細胞因子的產生、抗原遞呈失調以及調節(jié)性T細胞（T regulatory, Treg）的負性調控有關。Treg主要亞群的表面標志為CD4+CD25+，胞內表達的Foxp3是其特異功能性分子。研究表明CD4+CD25+Foxp3+Treg可對多種免疫細胞發(fā)揮抑制效應，通過抑制HBV特異性的CD4+和CD8+T細胞的活性，使病毒得不到徹底清除而持續(xù)感染，導致乙型肝炎的慢性化。Tr

3、eg的增殖及其免疫抑制功能與表面共刺激分子的表達有關。共刺激分子受體通過與其相應配體相互作用，介導正性或負性共刺激信號，調節(jié)T細胞的增殖、細胞因子的產生、細胞毒性以及細胞的凋亡和存活等來控制T細胞的活化。BTLA與PD-1都是免疫球蛋白超家族的負性共刺激受體分子，分別與其配體HVEM和PD-L1相互作用產生負性共刺激信號，抑制T細胞的活化、增殖及其免疫學功能。研究表明PD-1介導的負性共刺激信號通路在慢性丙肝病毒（Hepatitis C

4、 virus, HCV）感染患者中，通過抑制Treg的信號轉導及轉錄激活因子的磷酸化，阻斷IL-2的作用，從而負性調控Treg的增殖，但PD-1在CHB患者Treg的表達特性及其對Treg的調控作用目前尚無報道。此外，BTLA和HVEM在Treg上的表達特性、對Treg的調控作用、BTLA/HVEM變化對Treg的影響及其在CHB中的意義目前也尚未見報道。
　　本研究通過流式細胞術檢測了CD4+CD25+FoxP3+Treg在慢性

5、乙肝患者中的比率及其表面負性共刺激分子PD-1、PD-L1、BTLA、HVEM的表達特性，并分析了Treg數量與慢性乙肝臨床指標的相關性，以及分析了Treg表達的上述負性共刺激分子與臨床指標的相關性，探討了PD-1、BTLA/HVEM對Treg的調節(jié)作用和PD-L1參與構成Treg的抑制性功能，及其對 HBV慢性感染的影響，從而初步揭示了負性共刺激分子在Treg的表達特性及其意義，為臨床診斷提供有價值的指標。
　　一、慢性乙肝患者

6、CD4+CD25+FoxP3+Treg與其表面PD-L1的檢測及其與臨床指標相關性的分析
　　【目的】通過檢測慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg占CD4+T細胞的比率，及其表面PD-L1的表達水平，并分析其與臨床指標的相關性，探討Treg及PD-L1作為Treg抑制性功能分子對慢性乙肝的影響。
　　【方法】采用ELISA檢測乙型肝炎e抗原（HBeAg）等血清標志；采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA；

7、采用羅氏全自動生化分析儀檢測肝功能的指標；分離人外周血淋巴細胞，對CD4+CD25+Foxp3+Treg熒光標記后通過流式細胞術檢測，并用GraphPad Prism5.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。
　　【結果】慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的比例顯著高于健康人（P<0.05），并與慢性乙肝患者血清ALT及AST呈現正相關（P<0.05），但與HBV-DNA載量無較好的相關性；PD-L1在慢

8、性乙肝Treg中的表達較健康人顯著上調，且與Treg比率、肝損傷的血清標志物ALT、AST均呈顯著的正相關，與HBV DNA沒有顯著相關性。
　　【結論】慢性乙肝患者外周血Treg數量的增加并與肝損傷指標呈正相關性，這可能是由于其對HBV特異性CTL的免疫抑制作用的增強，從而使HBV持續(xù)感染并繼續(xù)惡化；PD-L1在CHB患者Treg上調表達并與Treg比率及肝損傷指標呈正相關，其可能參與了Treg對HBV特異性CTL的免疫抑制功能

9、，有利于病毒的持續(xù)感染，促進慢性乙肝的發(fā)生發(fā)展。
　　二、負性共刺激分子PD-1、BTLA和HVEM在慢性乙肝患者CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達特性及其與臨床指標相關性的分析
　　【目的】通過分析PD-1、BTLA和HVEM在CHB患者CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達及其與Treg數量及臨床指標的相關性，探討PD-1/PD-L1、BTLA/HVEM對Treg的負性調控作用及其變化對慢性乙肝的影響，為

10、臨床診斷和干預奠定理論基礎。
　　【方法】分離人外周血單個核細胞，采用4色熒光標記和流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg表面PD-1、BTLA與HVEM的表達，利用Flowjo軟件分析流式測定結果，及采用GraphPad Prism5.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。
　　【結果】PD-1在慢性乙肝Treg中的表達較健康人顯著下調且與Treg比率、肝損傷的血清標志物ALT、AST均呈顯著的正相關，與HBV DNA沒

11、有顯著相關性；BTLA和HVEM在慢性乙肝Treg中的表達較健康人顯著下調，且BTLA與HVEM的表達水平呈正相關，與Treg比率、PD-1、PD-L1及肝損傷的血清標志物ALT、AST均呈顯著的正相關，與HBV DNA沒有顯著相關性。
　　【結論】PD-1的慢性乙肝患者Treg的表達下調可能有助于乙肝患者體內Treg的擴增；BTLA和HVEM的表達也呈現同步下調，其與PD-1負性信號可能協同參與了對Treg的調控作用，該負性共刺

12、激分子與肝損傷指標呈相關性的免疫學作用機理則尚待進一步探討。
　　綜上所述，本研究初步闡明了CHB患者外周血Treg占CD4+T細胞的比率增加；Treg表達的負性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM相對于健康人呈下調，但隨著Treg數量的增加逐步上調，且與肝損傷指標呈正相關性；PD-L1在CHB患者呈現上調，且與Treg比率、肝損傷指標呈正相關性；從而表明負性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM可能參與了對Treg自身的調控，