rhTRAIL聯(lián)合As-,2-O-,3-治療胃癌的實驗研究.pdf

1、研究背景 細胞凋亡的異常減少是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征，因此促使腫瘤細胞凋亡被認為是治療腫瘤的有效手段。經典的凋亡途徑包括：線粒體通路(內源性途徑)和死亡受體通路(外源性途徑)，大多數(shù)抗癌藥物是通過上述途徑誘導腫瘤細胞凋亡從而發(fā)揮治療作用的。 腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導配體(Tumor Necrosis Fac-tor-relatedApoptosis-indllcing Ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子家族新成

2、員，屬于Ⅱ型膜糖蛋白。它的細胞外部分被特定的酶降解后形成可溶性分子，能與靶細胞表面的死亡受體特異性結合誘導多種組織來源的轉化細胞株及腫瘤細胞株凋亡，同時對正常細胞的影響較小，因而是廣受矚目的潛在的腫瘤治療手段。盡管在多項體內外研究中展現(xiàn)了良好的應用前景，但TRAIL作為抗癌藥物仍然面臨兩個問題：一方面，TRAIL仍然面臨著化療藥物普遍存在的耐藥性難題；另一方面，當TRAIL超過一定濃度后，將喪失對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用，誘導正常細胞凋

3、亡而帶來副作用。與此同時，越來越多的報道顯示，多種化療藥物可以增加腫瘤細胞對TRAIL的敏感性，在不增加毒性作用的前提下提高療效。因此，探索高效的TRAIL配伍使用方案具有重要的意義。 已有的研究表明：As<,2>O<,3>可以直接作用于線粒體通透性轉運孔道(MPTP)蛋白質巰基，促使線粒體電位下降，進而導致細胞凋亡。As<,2>O<,3>直接損傷線粒體從而啟動細胞凋亡程序的特點使其避開凋亡通路上線粒體上游的環(huán)節(jié)，減少了耐藥的

4、發(fā)生，因此對許多耐藥模型有效。 研究目的 研究As<,2>O<,3>與rhTRAIL這個配伍用藥方案對體外培養(yǎng)的胃癌細胞生長與凋亡的影響，并研究其發(fā)生機制，旨在探索胃癌治療新方案。 研究方法 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL抗胃癌細胞SGC7901的協(xié)同作用 ①分別用梯度濃度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL經不同時間處理人胃癌SGC7901細胞； ②MTT法檢測細胞生長

5、抑制率，計算出兩藥的IC<,50>值； ③熒光顯微鏡觀察細胞核內染色質的變化(Hochest33258熒光染色和AO/EB雙熒光染色法)； ④瓊脂糖凝膠電泳分析腫瘤細胞內生化指標的變化，看是否有DNA ladder出現(xiàn)； ⑤用AnnexinV-FITC和PI雙染色流式細胞術定量檢測細胞凋亡； ⑥分別用細胞毒性劑量(5μmol/L)和亞毒性劑量(lμmol/L)As<,2>O<,3>聯(lián)合rhTRAIL處理

6、SGC7901細胞，根據(jù)金正均方法判斷藥物相互作用效應； 2 線粒體途徑參與rhTRAIL與As<,2>O<,3>誘導胃癌細胞SGC7901凋亡 ①DiOC6熒光染色流式細胞術檢測各組細胞線粒體跨膜電位(△ψm)的變化； ②AnnexinV-FITC和PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡； ③比色法檢測各組細胞Caspase-8、9活性。 3 As<,2>O<,3>對SGC7901細胞TRAIL死亡

7、受體及cFLIP基因表達的影響 ①半定量RT-PCR和Western blot檢測As<,2>O<,3>處理前后TRAIL受體(DR<,4>，DR<,5>)和cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白水平的表達； ②間接免疫熒光染色流式細胞術檢測As203處理前后SGC7901細胞表面TRAIL死亡受體的表達。 研究結果 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL抗胃癌細胞SGC790

8、1的協(xié)同作用 ①As<,2>O<,3>和rhTAIL單獨應用均可以呈濃度和時間依賴性地抑制SGC7901細胞的生長，兩藥處理72h的IC<,50>分別為15.17μmol/L和384.35μg/L； ②As<,2>O<,3>和rhTRAIL單獨或聯(lián)合處理SGC7901細胞后，處理組部分細胞熒光顯微鏡下顯示凋亡細胞特有的染色質變化征象； ③一定濃度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL作用48 h后，提取細胞D

9、NA行瓊脂糖電泳分析，呈現(xiàn)出細胞凋亡時典型的DNA梯狀條帶； ④ Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內As<,2>O<,3>和rhTRAIL處理后，SGC7901細胞凋亡率顯著增加； ⑤5μmol/L(細胞毒性劑量)As<,2>O<,3>和200μg/LrhTRAIL聯(lián)合處理后，SGC7901細胞生長抑制率與凋亡率顯著升高，金正均方法分析表明兩藥聯(lián)用對細胞生長抑制、凋亡誘導有增強作用

10、： ⑥亞細胞毒性濃度(1μmol/L)As<,2>O<,3>增敏rhTRAIL對SGC7901細胞的生長抑制、凋亡誘導作用。 2 線粒體途徑參與rhTRAIL與As<,2>O<,3>誘導胃癌細胞SGC7901凋亡 ①As<,2>O<,3>與rhTRAIL均可以時間依賴性地導致SGC7901細胞線粒體跨膜電位下降，As<,2>O<,3>+TRAIL組SGC7901細胞△ψm下降程度大于單用任何一種藥物；

11、② rhTRAIL組細胞Caspase-8、9活性較對照組明顯升高；As<,2>O<,3>組細胞Caspase-9活性較對照組明顯升高； ③ caspase-8抑制劑Z-IETD-fmk部分拮抗rhTRAIL誘導的△ψm下降、Caspase-8、9活性升高與凋亡發(fā)生，而對As<,2>O<,3>的效應無顯著影響； ④二硫鍵還原劑(DTT)部分拮抗As<,2>O<,3>誘導的△ψm下降、Caspase-9活性升高與凋亡發(fā)

12、生，而對rhTRAIL的效應無顯著影響。 3 As<,2>O<,3>對SGC7901細胞TRAIL死亡受體及cFLIP基因表達的影響 ①SGC7901細胞存在TRAIL受體(DR<,4>，DR<,5>)在mRNA、總蛋白質以及細胞表面蛋白質等水平的表達；As<,2>O<,3>(1μmol/L)與As<,2>O<,3>(5μmol/L)聯(lián)合rsTRML或單獨處理均可上調SGC7901細胞TRAIL受體(DR<,4>，DR<

13、,5>)在各個水平的表達； ②SGC7901細胞存在cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白質水平的表達；As<,2>O<,3>處理對cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因mRNA、蛋白質表達水平無影響。 研究結論 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL可以呈濃度、時間依賴性的抑制SGC7901細胞生長，誘導其凋亡；不同濃度As<,2>O<,3>與rhTRAIL聯(lián)用均有協(xié)同抑制SG

14、C7901細胞生長，誘導其凋亡的效應。 2 As<,2>O<,3>通過破壞線粒體膜上蛋白質巰基從而直接激活線粒體相關途徑誘導SGC7901細胞凋亡；rhTRAIL與受體結合后可能通過caspase-8間接激活線粒體途徑誘導SGC7901細胞凋亡；As<,2>O<,3>與rhTRAIL聯(lián)用時，各自通過不同途徑作用于SGC7901細胞線粒體，增加其跨膜電位的降低以及由此導致的細胞凋亡，從而在誘導細胞凋亡方面形成協(xié)同作用。