口服RDP58肽誘導的Treg源性exosomes抑制大鼠腎移植排斥的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 排斥反應是導致移植后器官功能喪失的最主要原因，是移植物長期存活的主要障礙。探尋安全有效的抗原特異性免疫抑制方法，以實現(xiàn)移植物長期存活是器官移植領(lǐng)域最重要的任務(wù)之一，盡管近幾年各種免疫抑制劑的合理使用，有效的降低了器官排斥，增加了器官移植的成功率，對器官移植患者的長期存活和移植物保持良好功能都起著重要作用，但免疫抑制劑同時有自身不可克服的缺陷-抑制機體正常免疫功能。
　　 口服耐受是機體免疫系統(tǒng)對腸道接

2、觸的大量食物抗原和各種微生物形成的不反應狀態(tài)，是后天條件下機體維持對必須進入機體的外來抗原(食物抗原，腸道共生菌抗原)耐受的后天機制。其中，以腸系膜淋巴結(jié)為主的腸道淋巴系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)在上述耐受形成中起著至關(guān)重要的作用。
　　 體內(nèi)CD4+CD25+Treg是一群具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細胞，對效應性T細胞的活化和增殖起負調(diào)控作用；同時在器官移植后促使機體內(nèi)免疫平衡向耐受狀態(tài)發(fā)

3、展并維持耐受狀態(tài)中起著極其重要的作用。有效利用機體自身CD4+CD25+Treg調(diào)節(jié)移植術(shù)后異體移植物與受者間免疫功能調(diào)節(jié)能避免免疫抑制劑帶來的副作用。我們知道，exosome是多種活細胞晚期內(nèi)體以胞吐的方式分泌到細胞外形成，且不同細胞來源的exosome具有不同免疫功能，例如DC來源的exosome和B細胞來源的exosome富含MHCⅡ分子和共刺激分子(CD86、CD80)，是T細胞活化的必需共刺激分子；人類鼻咽癌來源的exosom

4、e含latent membrane protein gene1(LMP1)，能抑制T細胞活化效應；某些腫瘤來源的exosome能異常地表達Fas ligand(FasL)，誘導活化的細胞死亡(activated induced cell death，AICD)?，F(xiàn)已證實B細胞，T細胞，樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC細胞，肥大細胞和多種腫瘤細胞等均能分泌exosome。那么CD4+CD25+Treg細胞是否也能分泌exo

5、some，并通過其進行遠端調(diào)控？為證實這一設(shè)想，我們通過口服RDP58肽與霍亂毒素B型亞單位(cholera toxin B subunit，CTB)的交聯(lián)物誘導腸內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞，并收集到CD4+CD25+Treg源性exosome。
　　 材料和方法：
　　 本實驗旨在收集口服RDP58與CTB交聯(lián)后的產(chǎn)物誘導的特異性CD4+CD25+Treg細胞分泌的exosome，并建立大鼠急性腎移植模型后，過繼

6、轉(zhuǎn)移入CD4+CD25+Treg細胞源性exosome，體內(nèi)觀察exosome對移植腎存活時間、腎功能及移植腎病理組織學變化的影響；體外通過混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察其對T淋巴細胞增殖的影響。最后通過SDS-Page和質(zhì)譜系統(tǒng)(High Performance Liquid Chromatography-CHIP-MassSpectrometer，HPLC-CHIP-MS)對CD4+CD25+Treg源性exosome囊泡內(nèi)所含蛋白的組成進

7、行檢測與分析：
　　 (1)人工合成RDP58肽，并完成其分子量及純度檢測；
　　 (2)用交聯(lián)劑SPDP交聯(lián)RDP58衍生肽與CTB，用HPLC純化后并進行檢測；
　　 (3)建立大鼠腎移植模型，觀察RDP58-CTB交聯(lián)物口服后，對異體腎移植排斥的抑制效果，從而驗證RDP58肽結(jié)構(gòu)被衍生后，其功能學的變化；
　　 (4)口服灌胃RDP58-CTB交聯(lián)物，誘導腸系膜特異性CD4+CD25+Treg細胞；

8、
　　 (5)收集腸系膜淋巴結(jié)，流式分選收集CD4+CD25+Treg細胞，培養(yǎng)1-2周后，取上清液超速離心和密度梯度離心法收集exosome；
　　 (6)建立大鼠腎移植模型，過繼轉(zhuǎn)移入CD4+CD25+Treg源性exosome，并觀察其在體內(nèi)及體外的生物學功能；
　　 (7)Exosome蛋白質(zhì)譜分析：SDS-Page法和HPLC-CHIP-MS法來觀察exosome囊泡內(nèi)蛋白數(shù)量和種類。
　　 結(jié)

9、果：
　　 1、人工合成RDP58肽和衍生RDP58肽，純度均達95%以上，并用交聯(lián)劑SPDP，完成RDP58衍生肽與CTB的交聯(lián)；
　　 2、用prolene滑線作內(nèi)支架法建立大鼠腎移植模型，可有效提高手術(shù)成功率和減少缺血時間；
　　 3、口服交聯(lián)產(chǎn)物RDP58-CTB后能有效提高機體HO-1活性和抑制T淋巴細胞增殖，相對單獨應用RDP58而言能顯著改善移植腎存活時間和病理組織變化，并達到與腹腔注射RDP58相

10、同的治療效果；
　　 4、超濾法和密度梯度法收集到CD4+CD25+Treg細胞源性exosomes，電鏡下可見其為30-100nm均勻圓形小體，密度為1.13 to1.21 g/ml(漂浮在30%蔗糖/D2O中)；
　　 5、過繼轉(zhuǎn)移入CD4+CD25+Treg細胞源性exosomes后，體內(nèi)實驗有效延長移植腎存活時間、改善移植腎肌酐和尿素氮水平和組織學病理變化；體外能抑制T淋巴細胞增殖；
　　 6、用SDS-

11、polyacrylamide gel(SDP-Page)電泳初步觀察Exosome中蛋白組成數(shù)量，并進一步行蛋白質(zhì)譜分析，證實有數(shù)十種蛋白組成，包括cap adenylylcyclase-associated protein1、ldha L-lactate dehydrogenase A chain等蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1、RDP58肽與CTB交聯(lián)后，能有效提高抗原免疫原性，在體內(nèi)提高HO-1活性，延長移植腎存活