Smad4對膽管癌細(xì)胞的雙相調(diào)控作用.pdf

1、第一部分
　　目的:建立膽管癌Smad4KD穩(wěn)定細(xì)胞系并對其進(jìn)行鑒定。方法:采用用膽管癌細(xì)胞系HuCCT1和RBE作為研究對象,采用westernblotting檢測Smad蛋白的表達(dá),并用外源性TGF-β刺激膽管癌細(xì)胞后檢測Smad蛋白的磷酸化水平。從國外購買已被文獻(xiàn)驗(yàn)證的有效pRetroSuper-puroSmad4質(zhì)粒及其空載體。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞以包被逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。收集病毒上清,分別感染野生型膽管癌細(xì)胞系,建立Sma

2、d4干擾組以及相應(yīng)的空載體對照組。使用嘌呤霉素篩選獲得表達(dá)耐藥基因陽性的細(xì)胞系。以westernblotting和Co-immunoprecipitation檢測上述細(xì)胞系中Smad4蛋白的表達(dá)情況及Smad2/3/4復(fù)合物的形成情況。結(jié)果:HuCCT1和RBE細(xì)胞均表達(dá)TGF-βⅠ型受體、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7蛋白,而且外源性TGF-β時間依賴性地誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化。野生型和空載體對照組膽管癌細(xì)胞

3、均表達(dá)Smad4,干擾組膽管癌細(xì)胞的Smad4表達(dá)量顯著下降(P<0.01)。經(jīng)外源性TGF-β刺激后,干擾組膽管癌細(xì)胞無法形成正常量的Smad2/3/4復(fù)合物。結(jié)論:已成功建立穩(wěn)定干擾Smad4表達(dá)的膽管癌細(xì)胞系。
　　第二部分
　　目的:探討Smad4對膽管癌細(xì)胞生長的作用。方法:將TGF-β和或TGF-β受體Ⅰ抑制劑SB431542處理野生型HuCCT1細(xì)胞,分別于處理后的0d、1d、2d、3d、4d、5d和6d通過C

4、CK-8試劑盒檢測膽管癌細(xì)胞的增值情況。將TGF-β處理野生型RBE細(xì)胞,分別于處理后的0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h通過CCK-8試劑盒檢測膽管癌細(xì)胞的增值情況。在進(jìn)行Smad4干擾后,將外源性TGF-β處理野生型、空載體對照組和干擾組細(xì)胞5d(HuCCT1)或48h(RBE),再通過CCK-8試劑盒檢測各組膽管癌細(xì)胞的增值情況。采用westernblotting檢測各組HuCCT1細(xì)胞的cyclinA2和

5、p21蛋白的表達(dá)水平,以及RBE細(xì)胞的phospho-Rb和p21蛋白的表達(dá)水平。分別將野生型、空載體對照組和干擾組HuCCT1細(xì)胞注射入裸鼠皮下,觀察各組裸鼠的皮下成瘤情況。結(jié)果:TGF-β均能抑制HuCCT1和RBE細(xì)胞增殖。與野生型和空載體對照組細(xì)胞相反,干擾組RBE細(xì)胞對TGF-β抑制增殖的效應(yīng)不敏感;TGF-β對干擾組HuCCT1細(xì)胞的增殖僅有輕度抑制作用,而且干擾組HuCCT1細(xì)胞在沒有TGF-β作用下的生長速度快于野生型和

6、空載體對照組細(xì)胞。無論是有或無TGF-β作用,干擾組HuCCT1細(xì)胞的cyclinA2蛋白的表達(dá)水平均高于野生型和空載體對照組細(xì)胞,TGF-β誘導(dǎo)干擾組HuCCT1細(xì)胞表達(dá)p21蛋白的水平明顯低于空載體對照組;在TGF-β作用下,干擾組RBE細(xì)胞的Rb蛋白磷酸化水平高于野生型和空載體對照組,而p21表達(dá)量明顯低于野生型和空載體對照組。與野生型和空載體對照組HuCCT1細(xì)胞所形成皮下瘤相比,干擾Smad4的HuCCT1細(xì)胞在裸鼠皮下形成的

7、腫瘤體積更大。結(jié)論:Smad4介導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的生長抑制,其機(jī)制可能是通過降低cyclinA2的表達(dá)和Rb蛋白的磷酸化水平,以及介導(dǎo)p21表達(dá)。
　　第三部分
　　目的:探討Smad4對膽管癌細(xì)胞凋亡的作用。方法:將不同濃度的TGF-β處理野生型RBE細(xì)胞36h,以及將1ng/ml的TGF-β分別處理野生型RBE細(xì)胞0、12、24、36和48h,細(xì)胞經(jīng)PI/Annexin-Ⅴ染色后進(jìn)行流式細(xì)胞分析,檢測細(xì)胞凋亡,并且通過wes

8、ternblotting檢測不同時間點(diǎn)Bim和Bcl-2蛋白的表達(dá)以及caspase和PARP蛋白的激活情況;再將泛caspase抑制劑與TGF-β聯(lián)合作用于野生型RBE細(xì)胞36h后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。將1ng/ml的TGF-β分別處理空載體對照組和干擾Smad4組RBE細(xì)胞36h,采用同樣的方法檢測細(xì)胞凋亡。將TGF-β和/或JNK抑制劑SP600125作用于野生型RBE細(xì)胞36h后,通過流式細(xì)胞術(shù)分析比較各處理組細(xì)胞的凋亡

9、,通過westernblotting檢測Bim和Bcl-2蛋白的表達(dá)以及caspase和PARP蛋白的激活情況;將泛caspase抑制劑與TGF-β和/或SP600125聯(lián)合作用于野生型RBE細(xì)胞36h后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。將TGF-β和/或SP600125分別作用于空載體對照組和干擾Smad4組RBE細(xì)胞36h,然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析比較此兩組細(xì)胞的凋亡,通過westernblotting檢測Bim和Bcl-2蛋白的表達(dá)以及

10、caspase和PARP蛋白的激活情況。將TGF-β和/或SP600125作用于野生型RBE細(xì)胞6h后,通過westernblotting檢測Smad2和Smad3的磷酸化水平。將帶有熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型RBE細(xì)胞,然后將TGF-β和/或SP600125處理細(xì)胞24h,最后分析TGF-β誘導(dǎo)報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。將帶有熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入空載體對照組和干擾Smad4組RBE細(xì)胞,然后將TGF-β和/或SP600125分別

11、作用于兩組細(xì)胞24h,最后分析TGF-β誘導(dǎo)報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果:TGF-β劑量依賴性地和時間依賴性地誘導(dǎo)野生型RBE細(xì)胞發(fā)生凋亡。與空載體對照組相比,shSmad4RBE細(xì)胞對TGF-β的促凋亡效應(yīng)不敏感。SP600125增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)野生型RBE細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。與空載體對照組相比,shSmad4RBE細(xì)胞對SP600125的促凋亡效應(yīng)不敏感。接受泛caspase抑制劑處理的野生型RBE細(xì)胞對TGF-β和SP600125的促凋

12、亡效應(yīng)不敏感。TGF-β時間依賴性地誘導(dǎo)Bim表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、以及caspase和PARP蛋白激活。SP600125增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Bim表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)、以及caspase和PARP蛋白激活,該效應(yīng)在干擾Smad4表達(dá)后被阻斷。SP600125增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2和Smad3的磷酸化水平以及熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄水平。干擾Smad4表達(dá)能阻斷SP600125對TGF-β誘導(dǎo)熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)錄的

13、增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)論:Smad4介導(dǎo)TGF-β對RBE細(xì)胞的促凋亡效應(yīng),SP600125依賴Smad4介導(dǎo)增強(qiáng)TGF-β對RBE細(xì)胞的促凋亡效應(yīng),線粒體相關(guān)的caspase蛋白活化參與Smad4對凋亡的調(diào)控。
　　第四部分
　　目的:探討Smad4在膽管癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、遷移和侵襲中的作用。方法:將TGF-β1分別作用于野生型RBE細(xì)胞0、6、12、2

14、4和48h,通過westernblotting檢測不同時間點(diǎn)N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達(dá)。并于TGF-β1處理24h后在顯微鏡下觀察野生型RBE細(xì)胞的形態(tài)。將TGF-β1分別作用于空載體對照組和干擾Smad4組RBE細(xì)胞24h,在顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的形態(tài),通過westernblotting檢測兩組細(xì)胞N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達(dá)。對野生型HuCCT1細(xì)胞劃痕,經(jīng)TGF-β1和/或TGF-

15、β受體Ⅰ抑制劑SB431542處理24h后在顯微鏡下拍照。將TGF-β1和/或SB431542分別處理野生型HuCCT148h和72h后,通過westernblotting檢測N-cadherin、MMP-9和Vimentin的表達(dá)。對空載體對照組和干擾Smad4組HuCCT1細(xì)胞劃痕,經(jīng)TGF-β1和/或SB431542處理24h后在顯微鏡下拍照。將空載體對照組和干擾Smad4組HuCCT1細(xì)胞加入transwell小室內(nèi),用TGF-

16、β1和/或SB431542處理細(xì)胞24h,經(jīng)過固定和結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下計數(shù)并拍照。將空載體對照組和干擾Smad4組HuCCT1細(xì)胞加入事先包被Matrigel的transwell小室內(nèi),用TGF-β1和/或SB431542處理細(xì)胞48h,經(jīng)過固定和結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下計數(shù)并拍照。用TGF-β1和/或SB431542處理空載體對照組和干擾Smad4組HuCCT1細(xì)胞48h和72h,通過westernblotting檢測N-cadhe

17、rin、MMP-9和Vimentin的表達(dá)。將野生型、空載體對照組和shSmad4組HuCCT1細(xì)胞分別注射入裸鼠腹腔,于8周后觀察腫瘤細(xì)胞播散至膈肌并形成癌灶的情況。結(jié)果:TGF-β1誘導(dǎo)RBE細(xì)胞的形態(tài)由上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變,促進(jìn)N-cadherin表達(dá)增加和E-cadherin表達(dá)降低。在無TGF-β1處理時,Smad4干擾組細(xì)胞比空載體組細(xì)胞的形態(tài)更趨于上皮樣,E-cadherin表達(dá)水平也高于空載體組。在TGF-β1處理24h后

18、,Smad4干擾組細(xì)胞形態(tài)的間質(zhì)樣變化程度、N-cadherin表達(dá)量明顯低于空載體組;空載體組細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)缺失,而Smad4干擾組細(xì)胞仍表達(dá)E-cadherin。在劃痕實(shí)驗(yàn)中,TGF-β1促進(jìn)野生型HuCCT1細(xì)胞遷移;在有/或無TGF-β1刺激下,shSmad4HuCCT1細(xì)胞的遷移能力均弱于空載體對照組細(xì)胞。在transwell實(shí)驗(yàn)中,TGF-β1誘導(dǎo)shSmad4HuCCT1細(xì)胞直接穿出transwell小室底

19、膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于空載體對照組細(xì)胞;無論有無TGF-β1作用,shSmad4HuCCT1細(xì)胞通過Matrigel穿出transwell小室底膜的細(xì)胞數(shù)均明顯少于空載體對照組細(xì)胞。TGF-β1誘導(dǎo)野生型HuCCT1表達(dá)N-cadherin、MMP-9蛋白并增強(qiáng)Vimentin蛋白的表達(dá);無論有無TGF-β1作用,shSmad4HuCCT1細(xì)胞N-cadherin、MMP-9和Vimentin的表達(dá)水平均明顯低于空載體對照組細(xì)胞。與野生型和