甲狀腺激素促進(jìn)多發(fā)性硬化癥緩解期髓鞘再生修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是目前臨床最常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性脫髓鞘疾病，伴隨著運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、認(rèn)知功能障礙等臨床癥狀反復(fù)發(fā)作和緩解。其病理改變?yōu)榉翘禺愋缘闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)炎癥、脫髓鞘和軸突丟失，并隨著病程進(jìn)展會(huì)形成中樞脫髓鞘斑塊。多發(fā)性硬化癥的主要臨床癥狀有行走困難、疲勞、疼痛和記憶力下降等，這些癥狀的嚴(yán)重程度與中樞脫髓鞘病變的數(shù)量和炎癥、脫髓鞘和軸突損傷、髓鞘再生修復(fù)和軸突修復(fù)的程度密切相關(guān)。
　　

2、 在經(jīng)典的復(fù)發(fā)，緩解型MS病人的自然病史中，其癥狀緩解期被認(rèn)為是機(jī)體髓鞘再生修復(fù)和軸突功能代償?shù)年P(guān)鍵時(shí)期，脫髓鞘的軸突會(huì)被新形成的髓鞘重新包裹，軸突功能失常也能逐漸恢復(fù)，所以多發(fā)性硬化癥的緩解期也被認(rèn)為是髓鞘再生修復(fù)期。但是，原發(fā)性進(jìn)展型多發(fā)性硬化癥(the primary progressive MS，PPMS)和繼發(fā)性進(jìn)展型多發(fā)性硬化癥(the secondary progressive MS，SPMS)這兩種特殊類型的多發(fā)性硬化癥

3、病人，他們的緩解期并不明顯或根本不存在，PPMS和SPMS病人在第一次或第二次臨床發(fā)病后，病程進(jìn)展迅速，病情發(fā)展快，很快導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙和身體殘疾。
　　 PPMS和SPMS病人與經(jīng)典的復(fù)發(fā)一緩解型MS病人最明顯的區(qū)別，就發(fā)生在緩解期。為什么PPMS和SPMS病人病程進(jìn)展這么快而且預(yù)后也不好？可能就是在緩解期發(fā)生了一些阻止髓鞘再生修復(fù)和軸突功能修復(fù)的事件。所以關(guān)注緩解期，特別是關(guān)注緩解期的髓鞘再生修復(fù)可能是解決問(wèn)題的關(guān)鍵之所在

4、。
　　 另一方面，腦組織具有一定的少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化和髓鞘再生修復(fù)的能力，但隨著MS病程的進(jìn)展，這種髓鞘再生修復(fù)是不完全的，甚至是失敗的。所以經(jīng)典的復(fù)發(fā)-緩解型MS雖然具有緩解期，且其破壞的髓鞘在緩解期也能得到一定程度的再生修復(fù)，但是這種髓鞘再生修復(fù)隨著病程的發(fā)展是不能完全被補(bǔ)償?shù)?，所以，隨著病變積累，最終會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙和身體殘疾。
　　 目前，對(duì)MS的主要治療策略集中在抗免疫治療或稱之為免疫調(diào)節(jié)治療方面，雖然

5、能夠有效的緩解MS復(fù)發(fā)的頻率，但在對(duì)髓鞘再生修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)及功能殘疾發(fā)展方面并沒(méi)有太大的作用。
　　 綜上所述，關(guān)注髓鞘再生修復(fù)的關(guān)鍵時(shí)期也就是MS的緩解期顯得尤為重要。如果在這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期能夠保持足夠數(shù)量和有功能的髓鞘，或促進(jìn)其再生修復(fù)，進(jìn)而有效的促進(jìn)神經(jīng)功能保護(hù)，對(duì)MS的治療就會(huì)事半功倍。
　　 臨床研究報(bào)道，PPMS和SPMS與經(jīng)典的復(fù)發(fā)一緩解型MS在甲狀腺激素(Thyroidhormone TH)水平上明顯不同：在

6、MS病人的腦脊液中，甲狀腺激素水平明顯異常，其中TT4水平明顯升高，TT4/rT3比例升高；另外，腦脊液中rT3水平、TT4/rT3比例與MS的類型也有關(guān)系。但是，甲狀腺激素水平的變化到底是疾病的原因還是結(jié)果尚不清楚。相關(guān)的MS臨床案例提示我們，甲狀腺激素可能在決定MS病人的臨床類型和進(jìn)程預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，最可能的是，甲狀腺激素通過(guò)影響髓鞘再生修復(fù)過(guò)程來(lái)影響MS病人的緩解期，導(dǎo)致臨床癥狀發(fā)展的不同。
　　 大量研究表明，甲狀

7、腺激素是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不可缺少的激素之一，它參與神經(jīng)發(fā)育和髓鞘形成的關(guān)鍵過(guò)程，嬰兒期和青春期缺乏TH會(huì)導(dǎo)致呆小癥(以智力障礙和身材矮小為主要臨床表現(xiàn))。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在甲狀腺機(jī)能減退動(dòng)物模型中，髓鞘形成延遲；在甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)動(dòng)物模型中，髓鞘形成增加。甲狀腺激素是干細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)分化、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟、細(xì)胞停止分裂、終末髓鞘產(chǎn)生等過(guò)程中重要的影響和誘導(dǎo)因素。在急、慢性脫髓鞘動(dòng)物模型中，給予外源性的甲狀腺激素(T3)能夠促進(jìn)癥狀的緩解和髓鞘

8、再生修復(fù)。
　　 但在脫髓鞘模型中，甲狀腺激素的不足是否會(huì)對(duì)髓鞘再生修復(fù)產(chǎn)生影響，甲狀腺激素在髓鞘再生修復(fù)期間的重要性如何？特別是在MS的緩解期--這個(gè)髓鞘再生修復(fù)的關(guān)鍵時(shí)期，甲狀腺激素是否發(fā)揮獨(dú)特的作用？此時(shí)額外給予適量的外源性甲狀腺激素是否有利于促進(jìn)機(jī)體的髓鞘再生修復(fù)和癥狀的緩解以及疾病的恢復(fù)？其具體機(jī)制是什么？目前并沒(méi)有關(guān)于這些問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 Cuprizone(CPZ)是一種選擇性銅離子螯合劑，具有特異性

9、誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡作用，最終導(dǎo)致髓鞘損傷。CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘動(dòng)物模型是一個(gè)被廣泛用來(lái)研究脫髓鞘和髓鞘再生修復(fù)的經(jīng)典模型。我們應(yīng)用CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘，然后通過(guò)撤除藥物模擬MS疾病的緩解期，觀察此時(shí)的髓鞘再生修復(fù)情況，簡(jiǎn)述如下：CPZ誘導(dǎo)小鼠脫髓鞘模型通過(guò)喂食含0.2%CPZ的飼料6周而建立，可誘導(dǎo)明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變，然后，改為喂食正常飼料，讓小鼠自行恢復(fù)2周，使髓鞘逐漸再生修復(fù)，模擬MS病人的緩解期。在髓鞘再生修復(fù)的2周，干預(yù)小鼠

10、的甲狀腺激素水平，通過(guò)給予含0.15% PTU的飲用水，以抑制小鼠自身的甲狀腺激素分泌；同時(shí)，另一組給予腹腔注射外源性T3，以提高小鼠血清中的甲狀腺激素水平。在此基礎(chǔ)上，利用免疫組化、免疫熒光、電鏡、行為學(xué)、Western Blotting等技術(shù)方法，觀察甲狀腺激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)胼胝體區(qū)域的髓鞘再生修復(fù)和軸突保護(hù)的影響，并初步探討其細(xì)胞機(jī)制。
　　 主要的研究結(jié)果分為以下三部分：
　　 第一部分：甲狀腺激素對(duì)髓鞘再生修復(fù)

11、期間小鼠體重及運(yùn)動(dòng)能力的影響。
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和甲狀腺激素檢測(cè)
　　 CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠被分成4組，在誘導(dǎo)髓鞘再生的2周內(nèi)，CPZ+PTU組給予含PTU飲用水抑制甲狀腺激素，CPZ+N組給予正常飲用水作為對(duì)照；CPZ+T3組給予腹腔注射T3提高甲狀腺激素，CPZ+PBS腹腔注射PBS作為對(duì)照。同時(shí)設(shè)置4組正常小鼠作為CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘4組的對(duì)照，N+PTU組給予含PTU飲用水抑制甲狀腺激素，N組給予正常飲用水作為

12、對(duì)照；N+T3組給予腹腔注射T3提高甲狀腺激素，N+PBS腹腔注射PBS作為對(duì)照。在第6周末，利用LFB+MBP染色鑒定脫髓鞘模型的可靠性，發(fā)現(xiàn)CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘導(dǎo)致小鼠胼胝體區(qū)域大量脫髓鞘改變，證實(shí)了脫髓鞘模型建立成功。
　　 第8周末，為了驗(yàn)證小鼠甲狀腺激素水平的改變，用放射免疫法檢測(cè)了小鼠血清總T3和血清總T4水平，發(fā)現(xiàn)PTU能明顯抑制小鼠血清總T3/T4的水平，而腹腔注射T3能夠明顯提高小鼠血清T3水平，反饋性抑制小鼠血清

13、T4水平。證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)利用PTU和T3成功的干預(yù)了小鼠在髓鞘再生期的甲狀腺激素水平。
　　 2.小鼠體重監(jiān)測(cè)
　　 作為總體情況的監(jiān)測(cè)，每天稱重小鼠的體重改變作為最基礎(chǔ)和總體性的觀察。正常小鼠體重緩慢增加，在第8周體重增加了8.053±1.22g，而CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘導(dǎo)致小鼠體重急劇下降，在前2周體重丟失4.175±0.99g，在后面4周有緩慢的恢復(fù)并趨于穩(wěn)定，在第6周末體重丟失1.495±1.24g。而撤除CPZ誘導(dǎo)髓鞘

14、再生修復(fù)時(shí)，同CPZ+N對(duì)照組比較，CPZ+PTU組小鼠體重明顯受到了抑制，其平均相對(duì)體重最后只能恢復(fù)0.38±1.70g(CPZ+N：3.59±1.14g)P<0.05。而CPZ+T3組的小鼠體重同CPZ+PBS組比較并沒(méi)有明顯的恢復(fù)，但是同CPZ+PTU組相比卻有明顯的恢復(fù)，其平均相對(duì)體重最后恢復(fù)2.14±1.09g P<0.05。說(shuō)明甲狀腺激素對(duì)髓鞘再生修復(fù)期小鼠的總體情況具有顯著的促進(jìn)恢復(fù)作用。
　　 3.小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能

15、力和平衡能力監(jiān)測(cè)
　　 為了評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和平衡能力在髓鞘再生修復(fù)過(guò)程中的變化，我們利用旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)來(lái)記錄他們?cè)诟咚傩D(zhuǎn)棒上的維持時(shí)間。當(dāng)撤除CPZ飼料誘導(dǎo)髓鞘再生修復(fù)的時(shí)候，CPZ+N和CPZ+PBS兩個(gè)對(duì)照組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上的時(shí)間得到明顯的恢復(fù)，其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和平衡能力得到明顯改善，但是CPZ+PTU組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒的表現(xiàn)卻受到了明顯抑制，其在棒上維持時(shí)間停留在84.88±10.96s(CPZ+N：105.67±20.72

16、s)P<0.05。而CPZ+T3組小鼠在棒上維持時(shí)間卻得到明顯的提升，其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和平衡能力的到改善，其棒上維持時(shí)間恢復(fù)到120.10±14.70s(CPZ+PBS：106.13±14.38s)P<0.05。表明甲狀腺激素在髓鞘再生修復(fù)期間的不足，會(huì)明顯延緩小鼠的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力和平衡能力恢復(fù)，而提高甲狀腺激素水平，能夠促進(jìn)其協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力和平衡能力的明顯恢復(fù)。
　　 4.小鼠自發(fā)活動(dòng)和探索習(xí)性檢測(cè)
　　 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)小鼠

17、在新環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)強(qiáng)度和探索習(xí)性，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)被用來(lái)檢測(cè)小鼠在髓鞘再生修復(fù)2周后的曠場(chǎng)行為學(xué)表現(xiàn)。跟CPZ+N對(duì)照組小鼠相比，CPZ+PTU組小鼠在曠場(chǎng)中明顯的自發(fā)活動(dòng)和探索活動(dòng)減少，其運(yùn)動(dòng)總路程只有15803.98±1241.49mm(CPZ+N：20396.96±2047.39mm)P<0.05。而CPZ+T3組小鼠在曠場(chǎng)中的自發(fā)活動(dòng)和探索活動(dòng)有輕微的提升，其運(yùn)動(dòng)總路程也達(dá)到了21167.86±1646.75mm(CPZ+PBS：19

18、747.35±1682.llmm)P>0.05。但是小鼠的運(yùn)動(dòng)習(xí)性等高級(jí)功能卻沒(méi)有受到影響，各組的中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)路程比例和中間區(qū)域停留時(shí)間比例都維持在3.7%和2.4%左右。說(shuō)明了小鼠自發(fā)活動(dòng)強(qiáng)度的改變可能主要是運(yùn)動(dòng)能力變化而引起，而與高級(jí)功能改變可能關(guān)系不大。
　　 第二部分：甲狀腺激素對(duì)胼胝體髓鞘再生修復(fù)及少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的影響。
　　 1.甲狀腺激素促進(jìn)胼胝體髓鞘的再生修復(fù)
　　 甲狀腺激素在髓鞘再生修復(fù)期間

19、對(duì)小鼠體重和運(yùn)動(dòng)能力具有顯著性的促進(jìn)恢復(fù)作用，為了驗(yàn)證甲狀腺激素的上述作用是否是由于其對(duì)髓鞘再生修復(fù)的促進(jìn)效應(yīng)，本文以胼胝體區(qū)髓鞘為研究對(duì)象，用LFB組化染色和MBP免疫組化染色，Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證小鼠胼胝體區(qū)域髓鞘改變情況。發(fā)現(xiàn)同CPZ+N組相比較，CPZ+PTU組小鼠胼胝體髓鞘染色明顯稀疏，淺淡，且MBP髓鞘蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01)，而CPZ+T3組同CPZ+PBS組相比，其髓鞘染色明顯增多和致密，M

20、BP髓鞘蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。說(shuō)明在髓鞘再生期間，甲狀腺激素不足明顯抑制胼胝體髓鞘再生修復(fù)，而提高甲狀腺激素水平能明顯促進(jìn)胼胝體髓鞘的再生修復(fù)。
　　 2.甲狀腺激素促進(jìn)胼胝體有髓軸突的數(shù)量增多
　　 為了檢測(cè)甲狀腺激素對(duì)有髓軸突以及髓鞘厚度的影響，應(yīng)用電鏡技術(shù)檢測(cè)了各組胼胝體區(qū)髓鞘的改變，發(fā)現(xiàn)相比較于CPZ+N對(duì)照組，CPZ+PTU組胼胝體區(qū)域，正常髓鞘的軸突數(shù)量明顯減少(P<0.01)，裸露的軸突占主要

21、成分，其有髓軸突的髓鞘厚度并沒(méi)變薄，而CPZ+T3組，胼胝體區(qū)，正常髓鞘包裹的軸突明顯得到恢復(fù)，其裸露的軸突數(shù)量較CPZ+PBS對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，同樣有髓軸突的髓鞘厚度并沒(méi)有增厚。說(shuō)明在髓鞘再生修復(fù)過(guò)程中，甲狀腺激素的干預(yù)并沒(méi)有影響髓鞘的厚度，而是通過(guò)影響有髓軸突的數(shù)量來(lái)影響髓鞘的再生修復(fù)。
　　 3.甲狀腺激素促進(jìn)少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞增殖
　　 髓鞘再生修復(fù)的不同是否與中樞髓鞘形成細(xì)胞―少突膠質(zhì)細(xì)胞的改變有關(guān)

22、？為了進(jìn)一步驗(yàn)證胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞的改變，我們用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組胼胝體區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞各階段的改變。結(jié)果顯示CPZ+PTU組在髓鞘再生修復(fù)過(guò)程中甲狀腺激素的不足，會(huì)明顯影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟階段，成熟前階段以及前體階段，導(dǎo)致所有階段的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與CPZ+N組相比較，CPZ+PTU組前體階段只有其21.3%細(xì)胞數(shù)，成熟前階段只有其76.7%細(xì)胞數(shù)，成熟階段只有其58.7%細(xì)胞數(shù)。而且在室管膜下區(qū)(SVZ)幾乎沒(méi)有前體細(xì)胞的增生

23、。但是，提高甲狀腺激素水平卻能明顯促進(jìn)少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的增生。其胼胝體區(qū)成熟、成熟前、前體三個(gè)階段的細(xì)胞數(shù)得到了明顯的促進(jìn)和增生，特別是室管膜下區(qū)(SVZ)有大量的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞明顯增生。說(shuō)明，在髓鞘再生過(guò)程中，甲狀腺激素的不足，會(huì)顯著抑制少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的增殖，從而減少髓鞘的恢復(fù)；而提高甲狀腺激素的水平則能明顯促進(jìn)少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)髓鞘的再生修復(fù)。
　　 第三部分：甲狀腺激素對(duì)軸突、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞的

24、影響。
　　 1.甲狀腺激素促進(jìn)軸突的髓鞘包裹和生存
　　 為了檢測(cè)在髓鞘再生過(guò)程中，甲狀腺激素對(duì)軸突的影響，我們利用激光共聚焦技術(shù)和電鏡技術(shù)做了深入的觀察。發(fā)現(xiàn)相比較于CPZ+N對(duì)照組，CPZ+PTU組小鼠胼胝體區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量NF200陽(yáng)性染色多而MBP陽(yáng)性染色少的并存區(qū)域，紅色的NF200染色區(qū)域表現(xiàn)為連續(xù)的，長(zhǎng)線狀的并沿軸突走行方向延伸。這些結(jié)果提示胼胝體區(qū)域大量裸露的軸突存在。而CPZ+T3組相比較于CPZ+PBS

25、組則胼胝體區(qū)域表現(xiàn)為大量MBP陽(yáng)性染色增多而NF200陽(yáng)性染色減少的區(qū)域，并且NF200紅色染色不再表現(xiàn)為連續(xù)而長(zhǎng)線狀的染色，提示甲狀腺激素能夠明顯促進(jìn)髓鞘重新包裹裸露的軸突。同時(shí)，電鏡發(fā)現(xiàn)CPZ+PTU組的軸突線粒體明顯增大，其直徑幾乎是CPZ+N組的2倍，而且軸突形態(tài)較大，提示軸突的生存狀態(tài)惡化。而CPZ+T3組的軸突跟CPZ+PBS組一樣都已經(jīng)回歸正常的水平，處在改善的狀態(tài)。說(shuō)明，在髓鞘再生修復(fù)的過(guò)程中，甲狀腺激素能夠促進(jìn)髓鞘重新

26、包裹軸突，進(jìn)而改善軸突的生存狀態(tài)，促進(jìn)生存，改善其功能；而甲狀腺激素的不足，明顯抑制髓鞘重新包裹軸突，導(dǎo)致軸突的線粒體腫大，生存狀態(tài)惡化，影響其功能。
　　 2.甲狀腺激素減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生而對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞并沒(méi)有明顯影響
　　 在髓鞘再生修復(fù)過(guò)程中，提高甲狀腺激素的水平能夠明顯減少胼胝體區(qū)域星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生以及促進(jìn)其激活形態(tài)轉(zhuǎn)變成正常形態(tài)。而相反的，甲狀腺激素的不足，導(dǎo)致了胼胝體脫髓鞘區(qū)域大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，其細(xì)胞形

27、態(tài)也為激活狀形態(tài)。然而，甲狀腺激素的改變對(duì)胼胝體區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞的改變卻沒(méi)有明顯的影響，小膠質(zhì)細(xì)胞都在甲狀腺激素不足組和甲狀腺激素提高組都改變一致，沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明甲狀腺激素還可能通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和激活，影響髓鞘的再生。卻對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的改變沒(méi)有明顯的影響。
　　 在臨床上，MS病人發(fā)作期的預(yù)防治療一直以來(lái)得到足夠的重視，但是對(duì)MS病人緩解期的治療卻是關(guān)注不夠。關(guān)注緩解期這一髓鞘再生的關(guān)鍵時(shí)期，維持和促進(jìn)髓鞘再生應(yīng)該

28、是治療MS的理想策略。我們的實(shí)驗(yàn)研究提示在多發(fā)性硬化癥的緩解期這個(gè)重要的髓鞘再生過(guò)程中，機(jī)體的甲狀腺激素扮演了一個(gè)非常重要的角色：甲狀腺激素的不足通過(guò)減少少突膠質(zhì)譜系細(xì)胞增殖分化和有髓軸突的數(shù)量、引起軸突的生存狀態(tài)惡化以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和激活，導(dǎo)致髓鞘再生修復(fù)受阻、運(yùn)動(dòng)能力和體重恢復(fù)受阻；而提高甲狀腺激素水平則能明顯的逆轉(zhuǎn)和促進(jìn)上述的環(huán)節(jié)，但是甲狀腺激素對(duì)髓鞘厚度以及小膠質(zhì)細(xì)胞并不產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)研究提供了甲狀腺激素影響髓鞘再生修復(fù)