異丙腎上泉素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血壞死的自我修復(fù).pdf

1、背景
　　 心肌梗死是一種常見的心血管疾病，在其治療過程中實現(xiàn)心肌的再生修復(fù)一直是重點和難點問題。近幾年研究指出應(yīng)用各種干細(xì)胞療法能夠?qū)崿F(xiàn)心肌的再生修復(fù)。然而，關(guān)于心肌缺血壞死后心肌細(xì)胞能否進(jìn)行自然修復(fù)及哪些細(xì)胞參與到修復(fù)過程中目前仍沒有得到證實，本實驗就此問題進(jìn)行研究。
　　 目的
　　 采用鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)制備的大鼠心肌缺血動物模型，利用組織學(xué)和免疫熒光化學(xué)技術(shù)研究缺血壞死區(qū)組織病理學(xué)改變以及利用分子標(biāo)記

2、物如c-kit、CD34、Nanog、Gate4、Nkx2.5，縫隙連接蛋白connexin43，肌鈣蛋白CTnI，探討缺血壞死區(qū)增殖(遷移)細(xì)胞的生物學(xué)特征。
　　 材料和方法
　　 實驗選擇SD大鼠36只(雌、雄不限)，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體重180±20g。動物隨機分為實驗組(分1天、4周和8周組，每組8只)和對照組(8只)，實驗組按4mg/Kg的劑量腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素，連續(xù)注射7天；對照組注射等體

3、積生理鹽水。各組動物利用大鼠肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖評估造模是否成功。造模成功后，分別于1天、4周和8周，用10％水合氯醛麻醉動物，快速開胸取心，小心剪除心房和右心室游離壁，保留左心室下1/2心壁組織。每組快速取近心內(nèi)膜下心肌組織的電鏡材料，迅速用2.5%戊二醛固定，1%四氧化鋨后固定，常規(guī)脫水、透明、Epon812環(huán)氧樹脂包埋、制備超薄切片，硝酸鉛和醋酸鈾雙重染色，H-7500電子顯微鏡觀察。其它心壁組織用4%多聚甲醛固定，分別用20%、30%

4、蔗糖處理、OCT包埋、冰凍切片機制備冰凍切片，并于-20°冰箱保存待用。檢測：①HE染色光鏡下觀察4組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)；②電鏡下觀察心肌缺血壞死區(qū)的結(jié)構(gòu)；③免疫熒光技術(shù)檢測缺血壞死區(qū)內(nèi)遷移的細(xì)胞及分化的分子標(biāo)記，如干細(xì)胞分子標(biāo)記物CD34、c-kit、Nanog，心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子Gate4、Nkx2.5及心肌細(xì)胞標(biāo)記物Connexin43和CTnI，免疫熒光設(shè)陰性對照，用封閉液代替一抗，其它步驟相同。利用OlympusFV-1000

5、激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和采集熒光圖片。
　　 結(jié)果
　　 ①鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌缺血，肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖出現(xiàn)了典型心肌缺血壞死后ST段抬高心電圖改變。
　　 ②HE染色顯示心內(nèi)膜下出現(xiàn)心肌細(xì)胞缺血壞死區(qū)，HE染色呈淺染區(qū)。主要集中于左心室壁和室間隔靠近心內(nèi)膜及內(nèi)層心肌處，尤以心尖部為重。
　　 ③電鏡下可見心內(nèi)膜下出現(xiàn)心肌細(xì)胞缺血壞死區(qū)，壞死區(qū)可見成纖維細(xì)胞增殖、間質(zhì)纖維沉積、新生毛細(xì)血管形成及細(xì)

6、胞增生。
　　 ④心肌細(xì)胞缺血壞死區(qū)，早期表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物Nanog，中期可表達(dá)CD34、心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子Gate4，后期表達(dá)Connexin43、肌鈣蛋白CTnI。CD34的陽性結(jié)果主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈線性分布，染色清晰；Nanog的陽性結(jié)果主要定位于細(xì)胞膜上，條索狀分布，染色清晰；Gate4的表達(dá)不同階段發(fā)生轉(zhuǎn)位，早期定位于細(xì)胞核中，晚期則轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的周邊部，染色清晰；Connexin43呈散在點狀分布，位于細(xì)胞質(zhì)