AnnexinⅡ蛋白的原核表達(dá)和AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表達(dá)差異研究.pdf

1、Annexin II是鈣介導(dǎo)的磷脂結(jié)合蛋白超家族成員之一，表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞。Annexin II是纖維蛋白溶解酶原(PLG)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的共同受體，在血管內(nèi)皮上能顯著增加t-PA介導(dǎo)的纖溶酶形成效率。目前研究發(fā)現(xiàn)，Annexin II異常高表達(dá)是M3型急性髓系白血病(APL)出血合并癥的重要機(jī)制之一。此外，研究發(fā)現(xiàn)Annexin II還與某些實(shí)體腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、血管新生密切相關(guān)

2、。鑒于Annexin II的重要病理生理功能，本研究旨在基礎(chǔ)和臨床兩方面對(duì)Annexin II的功能作進(jìn)一步探討。我們用大腸桿菌為宿主表達(dá)了Annexin II融合蛋白，并以該重組蛋白為抗原免疫小鼠，用細(xì)胞融合和單克隆篩選技術(shù)制備了抗Annexin II單克隆抗體，利用所制備的單克隆抗體初步建立了流式方法檢測(cè)細(xì)胞表面Annexin II蛋白的表達(dá)水平；此外還運(yùn)用熒光定量PCR(Real-time PCR)方法對(duì)急性白血病細(xì)胞株以及急性白

3、血病病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞Annexin II mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定和比較，以進(jìn)一步探索Annexin II的功能及可能的作用機(jī)制。 1.Annexin II蛋白的原核表達(dá) 我們利用含有Annexin II全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pET-T1/C2-Annexin II轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) pLysS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。原核表達(dá)的重組Annexin II相對(duì)分子量約39kDa，經(jīng)Ni-NTA agaro

4、se柱純化獲得了部分純化的蛋白后免疫Balb/c小鼠。小鼠脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合后篩選獲得二株持續(xù)分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為S2-135和S2-136。兩株雜交瘤細(xì)胞單克隆后接種小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)分別為5×10-5和6×10-5。瓊脂糖雙擴(kuò)散法顯示兩株抗體皆為IgG1亞類。腹水經(jīng)蛋白G-Sephrose4B親和層析柱純化后濃度分別為0.25mg/ml和0.5mg/ml。Western blot分析顯示兩株單

5、抗均能夠識(shí)別相對(duì)分子量為39kDa的重組蛋白且能夠特異性地識(shí)別還原條件下NB4和U937細(xì)胞裂解液中分子量約36kDa的蛋白。本研究制備出抗AnnexinⅡ的特異性單克隆抗體，經(jīng)過(guò)鑒定表明該抗體具有較高的特異性和親和力，對(duì)于進(jìn)一步探討AnnexinⅡ的功能具有重要意義。 2.AnnexinⅡ在急性白血病患者中的表達(dá)差異及臨床意義 本研究探討急性白血病患者骨髓細(xì)胞AnnexinⅡ基因的表達(dá)水平。建立熒光定量PCR(Rea1

6、-time PCR)方法，檢測(cè)急性白血病細(xì)胞患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞AnnexinⅡmRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：AnnexinⅡ在NB4中的表達(dá)明顯高于其它細(xì)胞株，在U937以及SHI-1中也有較高表達(dá)。AnnexinⅡ在初治M3型急性白血病患者骨髓中的表達(dá)顯著高于其它類型急性白血病和正常對(duì)照者，此外在初治M5、M4患者骨髓中也有較高表達(dá)，而在初治M1以及M2患者中表達(dá)量與正常對(duì)照比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：AnnexinⅡ除在M3中高表達(dá)外