內(nèi)源性MRI鐵蛋白重鏈報告基因的體內(nèi)外成像.pdf

1、磁共振(MRI)報告基因在示蹤基因的表達有著無創(chuàng)、實時、空間分辨力高等優(yōu)勢,特別是在監(jiān)測基因治療、評價細胞分化、干細胞示蹤、評估微環(huán)境中的一些特定的代謝物活性等方面有著很大的應用前景。目前的MRI報告主要包括1)以酶為基礎的報告基因,如:β2-半乳糖核苷酶等；2)以受體為基礎的報告基因,其表達和特異的配體結(jié)合,可以引起MRI信號的改變；3)以金屬蛋白為基礎的報告基因,如:酪氨酸激酶,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。上述報告基因的MRI的成像都需要加入外

2、源性的對比劑,這些物質(zhì)克服生物屏障,從血液、非特異組織中的清除是當前MRI報告基因成像所面臨的巨大挑戰(zhàn)。
　　 鐵蛋白是一類普遍存在于動、植物和微生物體內(nèi),可以與鐵特異性結(jié)合的生物大分子。一般每分子鐵蛋白結(jié)合約4000 個鐵離子,形成一種超順磁性鐵蛋白,引起MRI的信號的改變。大量體內(nèi)外研究表明鐵蛋白的表達可以縮短 MRI的T2時間弛豫。由于鐵蛋白基報告基因不依賴外源性的對比劑,所以有很大的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。本文通過構(gòu)建小鼠

3、鐵蛋白重鏈質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細胞,通過體內(nèi)外的MRI成像,探討鐵蛋白作為一種新型內(nèi)源性MRI報告基因的可行性。
　　 第一部分 小鼠鐵蛋白重鏈基因質(zhì)粒構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細胞
　　 目的:應用 pcDNA3.1(-)質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶小鼠鐵蛋白重鏈全基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞,使其高表達,探索鐵蛋白基因作為一種新型內(nèi)源性磁共振分子影像報告基因的可行性。
　　 方法:從來源于小鼠肌肉的mRNA,根據(jù)Ge

4、nbank 中鐵蛋白序列設計引物,并在引物的5’端分別引入一對含有限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切位點逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),擴增出鐵蛋白重鏈全基因(Fth)片斷。通過限制性內(nèi)切酶 NotⅠ和BamH Ⅰ酶切和T4連接酶的作用,將鐵蛋白重鏈全基因插入到載體 pcDNA3.1(-)中,構(gòu)建鐵蛋白重鏈全基因質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Fth。構(gòu)建后經(jīng)雙酶切、測序等鑒定重組質(zhì)粒。酶切鑒定后,將重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導,轉(zhuǎn)染C6大

5、鼠膠質(zhì)瘤細胞。并通過免疫組化方式鑒定鐵蛋白重鏈基因在C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的表達情況及分布。
　　 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和BamH Ⅰ酶雙酶切成5.4Kb和588bp兩個片段,單酶切成約6Kb片段,表明成功構(gòu)建質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-Fth,并經(jīng)測序結(jié)果證明編碼框正確。細胞免疫組化的分析得到鐵蛋白重鏈基因在大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)獲得表達,表達主要在細胞漿內(nèi)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠鐵蛋白重鏈質(zhì)粒,并在大鼠膠質(zhì)瘤C6細

6、胞內(nèi)表達,為進一步探討鐵蛋白基因作為一種新型內(nèi)源性磁共振分子影像報告基因在細胞示蹤和基因顯像中的應用奠定了基礎。
　　 第二部分 小鼠鐵蛋白重鏈基因的體內(nèi)、外磁共振成像
　　 目的:應用鐵蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的大鼠膠質(zhì)瘤C6 細胞,行體內(nèi)、外的MRI成像,旨在探討其作為一種新型MRI內(nèi)源性報告基因的可行性及顯像特點。方法:將1.5×109 鐵蛋白重鏈基因轉(zhuǎn)染成功的大鼠膠質(zhì)瘤C6 細胞與未轉(zhuǎn)染鐵蛋白的大鼠膠質(zhì)瘤C6 制成細胞懸液

7、,行體外細胞群的T2-MAP和T2*-MAP的MRI掃描,在T2值及T2*偽彩圖上測量靠近中央位置的不同體素的T2值及T2*值,比較兩細胞的T2、T2*值的差異性,統(tǒng)計學方法使用兩獨立樣本的t檢驗。并通過普魯士藍實驗顯示細胞內(nèi)的鐵。
　　 SD 大鼠,體重 180～200g,雌雄不限,腹腔注射蔗糖鐵 50mg/kg,每三天注射一次,連續(xù)注射三周,高鐵模型的SD 大鼠構(gòu)建成功。
　　 將處于對數(shù)生長期的兩細胞種植于高鐵模型

8、的SD 大鼠(n=8)兩后肢皮下,左側(cè)后肢種植C6細胞,而右側(cè)后肢種植 C6-Fth 細胞,腫瘤生長至直徑約0.8～1.0cm,行荷瘤 SD 大鼠的MRI T2WI 掃描,腫瘤的中心位于表面線圈的中心線上,分析比較同一只大鼠的兩后肢的腫瘤在 T2WI 上的信號強度(SI腫瘤)與臨近等距離肌肉的信號(SI 肌肉)的比值(SI’)的差異性,統(tǒng)計學方法使用兩獨立樣本的t 檢驗。通過對腫瘤組織常規(guī)病理切片的普魯士藍實驗顯示腫瘤組織內(nèi)的鐵。

9、>　　 結(jié)果:應用 T2-MAP 及 T2*-MAP 序列,MRI掃描C6膠質(zhì)瘤細胞及 C6-Fth膠質(zhì)瘤細胞,兩種細胞的T2(t=-13.273,P<0.001)及 T2*(t=-3.284,P<0.05)值之間,差異均有統(tǒng)計學意義。經(jīng)高鐵荷瘤動物的體內(nèi)掃描,C6 及 C6-Fth腫瘤在 T2WI 上的信號強度(t=-5.292,p<0.001)差異有統(tǒng)計學意義。細胞爬片和腫瘤組織切片的普魯士藍實驗均證實 C6-Fth 細胞及 C6