細(xì)胞粘附激酶β信號(hào)通路在氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管中的作用及厄貝沙坦、氟伐他汀的干預(yù)研究.pdf

1、【目的】視網(wǎng)膜新生血管形成(retinal neovascularization，RNV)是多種缺血缺氧性眼底病共有的病理改變。RNV會(huì)引起視網(wǎng)膜纖維組織增生，視網(wǎng)膜脫離，甚至視力喪失，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家致盲性眼病的首要原因，也成為威脅我國(guó)人民視力健康的重要原因。明確RNV發(fā)生發(fā)展及其調(diào)控的分子機(jī)制，并進(jìn)而尋找新的非侵入性的治療方法已成為眼底病研究的重要課題。細(xì)胞粘附激酶β(cellular adhesion kinaseβ，CAKβ)是一

2、種能被細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高及多種刺激信號(hào)激活的具有明顯的酪氨酸激酶和自身激酶活性的信號(hào)分子，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等，與細(xì)胞多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和多種生物學(xué)功能有密切關(guān)系。然而，CAKβ在RNV中的作用及其與VEGF的關(guān)系尚不清楚。本研究建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成模型，觀察VEGF、CAKβ基因及蛋白的表達(dá)，探討CAKβ通路在RNV中的作用以及氟伐他汀、厄貝沙坦干預(yù)對(duì)其的影響。
　　 【方法】參照文獻(xiàn)建立氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管

3、形成（oxygen-induced retinopathy，OIR）模型。（1）選擇健康7日齡（P7）C57BL/6J小鼠，共80只，雌雄不拘。隨機(jī)分為高氧組(OIR組)和對(duì)照組(C組)。分別在P12、P14、P17、P19處死幼鼠。（2）選擇P7 C57BL/6J小鼠共180只，雌雄不拘。隨機(jī)分為C組、OIR組及模型+貝伐單抗組(BVZ組)。BVZ組在P12時(shí)腹腔麻醉后玻璃體內(nèi)注射貝伐單抗5mg/Kg，分別在P12、P14、P17處死

4、幼鼠。（3）選擇P7 C57BL/6J小鼠共140只，雌雄不拘。隨機(jī)分為5組：C組、模型+氟伐他汀組（FVS組）（P12時(shí)腹腔麻醉后雙眼玻璃體內(nèi)注射氟伐他汀10mg/Kg/d）、模型+厄貝沙坦組（IBS組）（P12時(shí)腹腔麻醉后雙眼玻璃體內(nèi)注射厄貝沙坦50mg/Kg/d）、模型+氟伐他汀組+厄貝沙坦組（FVS+IBS組）（P12時(shí)腹腔麻醉后雙眼玻璃體內(nèi)注射同上劑量的氟伐他汀及厄貝沙坦）、OIR組。P17處死幼鼠。（4）視網(wǎng)膜組織切片及鋪片

5、定性及定量觀察RNV；2',7'-二氯雙氫熒光素雙乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA、CAKβmRNA表達(dá)，Western blot技術(shù)檢測(cè)VEGF蛋白、CAKβ及其Tyr402磷酸化蛋白表達(dá)。
　　 【結(jié)果】（1）將P7幼鼠置于75％高氧環(huán)境5天后移至正常氧環(huán)境，可成功誘導(dǎo)出RNV模型。P14即可產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管，P17新生血管最明顯。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)RO

6、S水平改變與定量及定性觀察到的視網(wǎng)膜新生血管變化相一致。（2）正常新生小鼠P12時(shí)，視網(wǎng)膜VEGF mRNA及蛋白表達(dá)，CAKβmRNA及蛋白表達(dá)，CAKβTyr402/CAKβ比值均處于最高；OIR組自P12開(kāi)始，VEGF mRNA及蛋白表達(dá)，CAKβmRNA及蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)顯著升高，到P17時(shí)達(dá)高峰，CAKβTyr402/CAKβ比值在P14，P17也顯著高于對(duì)照組；貝伐單抗干預(yù)后第2天，VEGF mRNA及蛋白表達(dá)即顯著低于

7、同時(shí)段OIR組，與同時(shí)段C組無(wú)顯著差異，其后一直處于較低水平。CAKβmRNA及蛋白表達(dá)也顯著低于同時(shí)段OIR組，但仍顯著高于同時(shí)段C組。表明貝伐單抗對(duì)于VEGF及CAKβ的表達(dá)均具有良好的抑制作用，但對(duì)CAKβ的抑制效率不及VEGF。（3）厄貝沙坦干預(yù)組及氟伐他汀干預(yù)組新生血管增生情況明顯延緩，突破內(nèi)界膜的細(xì)胞核計(jì)數(shù)均顯著少于非干預(yù)組，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)、CAKβmRNA以及CAKβ及其Tyr402磷酸化蛋

8、白均較非干預(yù)組有顯著下降。而兩藥聯(lián)用在上述指標(biāo)均優(yōu)于各自單獨(dú)用藥。
　　 【結(jié)論】（1）氧化應(yīng)激、VEGF及CAKβ在RNV中起重要作用。（2）貝伐單抗對(duì)VEGF及CAKβ均具有良好的抑制作用，但對(duì)CAKβ的抑制效率不及VEGF。（3）厄貝沙坦及氟伐他汀均能有效降低ROS水平、下調(diào)VEGF及CAKβ表達(dá)，改善血管新生。兩藥聯(lián)用更有利于改善視網(wǎng)膜新生血管形成。（4）CAKβ參與了RNV的多種信號(hào)通路，CAKβ可能是抗RNV治療的一