金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-fve)表達(dá)特性及活性特征研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號(hào)：B13116學(xué)位論文金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPfve)表達(dá)特性及活性特征研究指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：孔祥輝柳參奎教授博士學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)2013年4月論文答辯日期：2013年6月13日東北林業(yè)大學(xué)授予學(xué)位日期：2013年6月答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：素夕厶櫛素大學(xué)摘要摘要免疫球蛋白(Immunoglobin，Ig)是代表機(jī)體體液免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在體內(nèi)承擔(dān)免

2、疫調(diào)節(jié)作用，開發(fā)的產(chǎn)品已被用于治療免疫相關(guān)疾病。Ig具有由2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成的“Y”型結(jié)構(gòu)，頂端的可變區(qū)是Ig主要活性區(qū)域。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FungalimmunomodulatoryproteinFIP)是從真菌中分離的一類結(jié)構(gòu)與Ig重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)極其相似而且具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子蛋白質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)7種FIPs，其中來源于金針菇的免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPfromFlammulinavelutipes，F(xiàn)IP—fve)經(jīng)研究具有免疫

3、調(diào)節(jié)作用，具有激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、預(yù)防治療哮喘、鼻炎、濕疹等過敏癥和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等生物活性。本研究通過RTPCR方法獲得FIP—fvecDNA序列，構(gòu)建克隆載體pUC19FIPfl，e和表達(dá)載體pET30a()FIPfve，后者經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)并進(jìn)行重組蛋白表達(dá)研究。確定了重組菌株高效可溶性表達(dá)條件為28℃，02raMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，表達(dá)率為30％以上。優(yōu)化的菌體裂解方法

4、為超聲波法(200w，5s，30min)結(jié)合溶菌酶法，菌體裂解率達(dá)98％以上。采用鎳離子親和樹脂建立柱式規(guī)?；兓に嚝@得單一蛋白，使HisFIPfve產(chǎn)率達(dá)291mg／L，純度97％以上，經(jīng)研究?jī)龈晒に嚝@得了形態(tài)穩(wěn)定、溶解性好、可用于注射的HisFIP—fve凍干粉針劑型。通過圓二色譜(CD)測(cè)定HisFIPfve二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明其在大腸桿菌Transetta(DE3)@得到了正確折疊和有效表達(dá)，形成了具有低含量葉螺旋(15％)和高

5、含量B折疊(38％)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且具有少量B一轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，相應(yīng)比例和天然蛋白相似，證明重組蛋白從二級(jí)結(jié)構(gòu)上具備了有生物學(xué)活性的前提條件。研究了重組蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性，通過ELISA實(shí)驗(yàn)研究了HisFIPfve對(duì)小鼠血清中三種細(xì)胞因子(IL2、IL一4和IFN7)含量的影響。結(jié)果：低劑量組(5mg／kg)小鼠血清中IL2和IFN丫的含量最高，與空白對(duì)照組比較差異極顯著(p005)，表明重組HisFIPfve具有促進(jìn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IL2和I

6、FN1，的活性，而對(duì)IL4水平無顯著影響。同時(shí)通過RTPCR方法研究發(fā)現(xiàn)His—FIPfve能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子IFNY和IL2基因的表達(dá)。此外，通過其他原核表達(dá)載體表達(dá)了FIPfve。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX4t1FIP—fve并誘導(dǎo)表達(dá)，利用Gst親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，融合蛋白產(chǎn)率為58mgn。并用凝血酶切割掉Gst標(biāo)簽，得到了單純FIP—fve蛋白。該表達(dá)率較低，工藝較復(fù)雜，表達(dá)產(chǎn)物活性還需進(jìn)一步研究。目前對(duì)該蛋白的研究主