漢族人群類風濕關節(jié)炎與細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3的研究.pdf

1、背景：
　　 類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是慢性，進行性，主要侵蝕外周滑膜關節(jié)，以對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病。我國類風濕關節(jié)炎的患病率約為0.32％～0.36％，是造成人群喪失勞動力與致殘的主要病因之一。流行病學調(diào)查顯示，類風濕關節(jié)炎的發(fā)病與性別，年齡，遺傳因素，免疫紊亂，環(huán)境因素密切相關。類風濕關節(jié)炎多發(fā)于女性，與男性的比例為3:1。類風濕關節(jié)炎80％發(fā)病于3

2、5-50歲。家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)類風濕關節(jié)炎先證者的一級親屬發(fā)生類風濕關節(jié)炎的概率為11％。對孿生子的調(diào)查結(jié)果顯示，單卵孿生子同時患類風濕關節(jié)炎的概率為12％～30％，而雙卵孿生子同時患類風濕關節(jié)炎的概率只有4％。免疫紊亂被認為是類風濕關節(jié)炎主要的發(fā)病機制，是以活化的CD4+T細胞和MHC-Ⅱ型陽性的抗原遞呈細胞(antigen presentingcell，APC)浸潤滑膜關節(jié)為特點的。在病程中T細胞和滑膜的巨噬細胞受抗原的刺激而活化，TNF

3、-α、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子增多，關節(jié)滑膜處于持續(xù)增生炎癥狀態(tài)。炎癥破壞關節(jié)軟骨和骨，造成關節(jié)畸形。IL-1、IL-6等引起類風濕關節(jié)炎全身性癥狀如低熱、乏力、急性期蛋白合成增多，C反應蛋白和血沉升高。生物制劑如IL-1拮抗劑，IL-6，及TNF-α拮抗劑，CTLA4和CD20單克隆抗體等，在國內(nèi)外逐漸用于治療類風濕關節(jié)炎，臨床試驗提示它們有抗炎及防止骨破壞的作用。細胞因子通過激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子(

4、Januskinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)途徑而發(fā)揮作用，而細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子家族(SOCS)是JAK/STAT通路唯一的反饋抑制因子，又被稱為細胞的“分子剎車”，在維持機體免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要作用。細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子家族一共有8個成員，包括細胞因子誘導SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(CIS)和SOCS1-7。這些家族成員都是細胞內(nèi)的一種信

5、號調(diào)節(jié)蛋白，結(jié)構(gòu)相似，氨基端(N末端)是不同長度的可變區(qū)域，中間是一個SH2結(jié)構(gòu)域，羧基端(C末端)是一段保守序列，約40個氨基酸大小的SOCS盒子。人類SOCS3作為SOCS家族一員，最早發(fā)現(xiàn)于1997年，基因在染色體上的位置為17q25.3，有兩個包含2729個核苷酸的外顯子組成。外顯子2編碼序列由678個連續(xù)核苷酸組成，編碼225個氨基酸。SOCS3是細胞內(nèi)的一種信號調(diào)節(jié)蛋白，正常情況下，SOCS3的mRNA在骨髓和脾等組織，以及

6、外周血細胞表達很低。但在細胞因子或其它刺激物誘導后，SOCS3的mRNA表達上調(diào)，其表達方式和時間因刺激因子和所在組織不同而改變。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)系指人類基因組中大量存在的單個核苷酸的差異.核苷酸序列的一定差異決定了不同人種和不同個體的差異，以及不同人群疾病易感性和藥物治療敏感性的差異。因此，SNP是一個具有高度穩(wěn)定性的遺傳學標記，可以成為尋找疾病相關基因，進行疾病診斷

7、、預防和藥物篩選的基礎。目前，對SNP的檢測方法多種多樣，如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異性擴增(ASA)和質(zhì)譜法等。四引物擴增受阻突變體系PCR(tetra-primer amplification refractory mutation systemPCR，tetra-ARMS-PCR)方法擴增的338bp片段的一級結(jié)構(gòu)特征是GC含量高達77％。GC含量高，Tm值就高。高GC含量模板

8、擴增必須用耐熱性DNA聚合酶。SNP中其3’端正好與SNP位點重合，由引物的3’端控制著引物的延伸反應，根據(jù)延伸產(chǎn)物的長度確定SNP類型。為提高SNP測定的特異性，在特異性引物的3’端倒數(shù)第3個堿基引入了一個人為錯配堿基，當錯配堿基數(shù)目達到一定程度同時反應條件達到一定的嚴謹程度時，3’末端堿基因磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應終止，得不到特異條帶，表明沒有與之相應的突變，反之則有。所以必須使用缺少3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚

9、合酶。設計4條引物進行PCR擴增，其中F1F2外引物(F1：C-920A-o-F：5’CCG CGC TCA GCC TTT CTC TGC TGC GA3’；F2：C-920A-o-R：5’AGT CCA CAA AGG AGC CTT CGC GCG CG3’)用于擴增一段含有SNP位點的338bp片段，另一對N1N2內(nèi)引物(N1：C-920A-i-F：5’CCC GCACGC AGC CAG CCG TCC3’；N2：C-920A

10、-i-R：5’AGC TGG GCC GGG CGG GCG ACT3’)為SNP位點特異性引物，4條引物在單管中同時進行PCR擴增反應，根據(jù)延伸產(chǎn)物的長度確定SNP的類型。其中F1F2擴增的338bp片段，是必須出現(xiàn)的條帶；F1N2是210bp，基因型是A；F2N1是170bp，基因型是C。
　　 我們研究中國漢族人群SOCS35’非翻譯區(qū)(外顯子2)內(nèi)的-920 C>A(rs12953258)和啟動子區(qū)的-1044C>A的單

11、核苷酸多態(tài)性，以及兩個基因位點是否存在連鎖不平衡(PDT)，即SOCS3的編碼序列(-920 C>A)和啟動子區(qū)(-1044C>A)的連鎖關系。
　　 目的：
　　 研究SOCS3的-1044C>A(外顯子2的ATG上游堿基)和-920 C>A(rs12953258)兩個位點在中國漢族人群的突變頻率，類風濕關節(jié)炎患者和健康對照是否存在差異，以及兩個位點有無連鎖不平衡(PDT)，對類風濕關節(jié)炎的發(fā)病機制和診斷有重要意義。<

12、br>　　 方法：
　　 1.實驗組類風濕關節(jié)炎患者100例，全部符合美國風濕病學院(ACR)1987類風濕關節(jié)炎的分類標準，對照組健康漢族人100例，性別及年齡相匹配。記錄其臨床資料，并收集抗凝的外周血2ml。
　　 2.提取DNA。
　　 3.四引物擴增受阻突變體系PCR檢測SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位點，用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測SOCS3的-1044C>A位點

13、。電泳，根據(jù)電泳條帶描述基因型。
　　 4.測序。
　　 結(jié)果：
　　 1.100名類風濕關節(jié)炎患者中82名類風濕因子陽性。
　　 2.SOCS3的-920 C>A(rs12953258)位點，中國漢族人群類風濕關節(jié)炎患者基因型CC3％，AC89％，AA8％；健康對照組基因型CC9％，AC82％，AA9％。
　　 3.SOCS3的-1044C>A位點，中國漢族人群類風濕關節(jié)炎患者基因型CC100％

14、，ACO％，AAO％；健康對照組基因型CC100％，ACO％，AAO％。
　　 4.200名中國漢族人群SOCS3的編碼序列(-920 C>A)和啟動子區(qū)(-1044C>A)的連鎖關系，PDT顯示了沒有傳遞不平衡。
　　 結(jié)論：
　　 1.100名類風濕關節(jié)炎患者中82名類風濕因子陽性，其中女性67名基因型是AC59AA6CC2，男性15名基因型是AC12AA2CC1，共計82名基因型是AC71AA8CC3。

15、r>　　 2.丹麥后裔的高加索人群SOCS3的-920 C>A(rs12953258)基因型CC92％，ACO％，AA8％。而中國漢族人群類風濕關節(jié)炎患者基因型CC3％，AC89％，AA8％；健康對照組基因型CC9％，AC82％，AA9％。說明人種差異。
　　 3.丹麥后裔的高加索人群SOCS3的-1044C>A基因型CC99％，ACO％，AA1％。而中國漢族人群類風濕關節(jié)炎患者基因型CC100％，ACO％，AAO％，健康對照