IRF-3基因沉默對(duì)骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞生物免疫學(xué)功能及aGVHD影響的研究.pdf

1、第一部分 IRF-3基因沉默對(duì)骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞生物免疫學(xué)功能的影響研究
　　 目的：
　　 樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)具有激活免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)免疫耐受的功能，未成熟狀態(tài)的樹(shù)突狀細(xì)胞傾向于誘導(dǎo)免疫耐受產(chǎn)生，被稱為致耐受DC(tolerogenicdendritic cell，Tol DC)。本實(shí)驗(yàn)在成功建立體外擴(kuò)增高純度小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cel

2、l，BM-DC)方法的基礎(chǔ)上，利用最新的RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)針對(duì)DC成熟的依賴途徑中關(guān)鍵基因IRF-3基因，篩選出最佳的shRNA PCR表達(dá)框序列，用于構(gòu)建IRF-3基因沉默的RNAi-IRF-3-DC，并從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)、細(xì)胞免疫功能等方面對(duì)RNAi-IRF-3-DC的生物免疫學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，以期構(gòu)建出IRF-3基因沉默的全新致耐受DC，RNAi-IRF-3-DC，驗(yàn)證其誘導(dǎo)

3、T細(xì)胞免疫耐受特性及可能機(jī)制，為其成功用于治療移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、小鼠骨髓DC的體外培養(yǎng)與鑒定研究分離C57BL/6小鼠骨髓前體細(xì)胞，在重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)刺激下，貼壁篩選方法，培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓來(lái)源DC(BM-DC)，并通過(guò)TNF-α刺激誘導(dǎo)DC成熟。實(shí)驗(yàn)分成兩組：①Control-DC組：手法篩選

4、的第8天的DC細(xì)胞，即未成熟DC組；②TNF-α-DC組：在培養(yǎng)結(jié)束前48h(第6天)加入TNF-α刺激的DC細(xì)胞，即成熟DC組。分別從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction MLR)等方面鑒定體外培養(yǎng)的未成熟DC與成熟DC。
　　 2、樹(shù)突狀細(xì)胞IRF-3基因沉默及效果檢測(cè)研究根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則預(yù)先設(shè)計(jì)3段IRF-3 shRNA序列，采用金思特公司PCR表達(dá)框試劑

5、盒，構(gòu)建出相應(yīng)的3種IRF-3shRNA表達(dá)框(R1/shRNA、R2/shRNA、R3/shRNA)，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成熟DC。實(shí)驗(yàn)分為六組：①Control-DC組；②TNF-α-DC組；③R1/shRNA轉(zhuǎn)染組：用R1/shRNA轉(zhuǎn)染成熟DC；R2/shRNA轉(zhuǎn)染組：用R2/shRNA轉(zhuǎn)染成熟DC；⑤R3/shRNA轉(zhuǎn)染組：用R3/shRNA轉(zhuǎn)染成熟DC；⑥GFP/shRNA轉(zhuǎn)染組：用GFP/shRNA轉(zhuǎn)染成熟DC，也即本實(shí)驗(yàn)的陰性

6、對(duì)照組)。采用RT-PCR分別在mRNA水平檢測(cè)比較各組DC的IRF-3基因表達(dá)情況，篩選出IRF-3基因沉默效果最好的有效shRNA序列。
　　 3、IRF-3基因沉默對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的生物免疫學(xué)功能影響研究成功構(gòu)建shRNA-IRF-3 DC基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)分成四組：①Control-DC組；②TNF-α-DC組；③IRF-3基因沉默組(shRNA-IRF-3-DC)：第6天經(jīng)過(guò)IRF-3 shRNA處理的培養(yǎng)第8天的DC；④TNF

7、-α刺激的IRF-3基因沉默組(TNF-α-shRNA-IRF-3-DC)第6天經(jīng)過(guò)IRF-3 shRNA處理和結(jié)束前加入TNF-α(15ng/mL)刺激48h的培養(yǎng)第8天收集的DC。分別從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等方面對(duì)shRNA-IRF-3 DC的生物免疫學(xué)特性進(jìn)行了比較研究。
　　 結(jié)果：
　　 1、在rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)下，可從小鼠骨髓培養(yǎng)擴(kuò)增出大量DC。每只小鼠獲得BM-DC約

8、1-2×107個(gè)，完全滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　 2、Control-DC組細(xì)胞形態(tài)多為圓形、皺褶多、突起較少、細(xì)胞器也少。胞內(nèi)較多吞飲泡，細(xì)胞表型檢測(cè)MHCⅡ類分子低水平表達(dá)，共刺激分子低表達(dá)(CD80、CD86)，MLR表明該類DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖能力較弱，表現(xiàn)出未成熟DC的特點(diǎn)。TNF-α-DC組細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，DC胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)減少，線粒體，粗面、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均顯著增多，表面有大量細(xì)長(zhǎng)的樹(shù)枝狀突起。與Con

9、trol-DC相比，細(xì)胞表面共刺激分子呈高水平表達(dá)，刺激T細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.001)，呈現(xiàn)成熟DC特征。
　　 3、PCR表達(dá)框方法可以得到設(shè)計(jì)好的針對(duì)IRF-3基因3個(gè)不同位點(diǎn)的IRF-3shRNA，可用于骨髓未成熟DC的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。RT-PCR顯示，與另外兩個(gè)位點(diǎn)相比，R2/shRNA可以明顯抑制細(xì)胞IRF-3基因表達(dá)(P<0.001)。
　　 4、shRNA-IRF-3 DC形態(tài)為圓形或橢圓性、胞內(nèi)有大量

10、囊泡結(jié)構(gòu)、部分囊泡可見(jiàn)吞噬的異物、細(xì)胞核多偏向一側(cè)、溶酶體和線粒體等細(xì)胞器少、表面突起少、形態(tài)較規(guī)則；細(xì)胞表達(dá)CD86、CD80表面分子較低。
　　 5、shRNA-IRF-3 DC刺激T細(xì)胞增殖能力較Control-DC大致相同(P值>0.05)；TNF-α刺激后shRNA-IRF-3-DC刺激T細(xì)胞增殖能力未見(jiàn)明顯增高，與TNF-α-DC組DC的MLR能力差異仍有顯著性(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　

11、 1、小鼠骨髓前體細(xì)胞在rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)下，可擴(kuò)增到大量的DC。
　　 2、手法篩選可以得到85％以上純度的DC，適合應(yīng)用于DC的分子免疫學(xué)研究。
　　 3、R2/shRNA PCR表達(dá)框轉(zhuǎn)染DC可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯抑制細(xì)胞IRF-3基因表達(dá)，不影響細(xì)胞活力和形態(tài)，是最佳的候選shRNA靶位點(diǎn)，適合用于構(gòu)建shRNA-IRF-3 DC。
　　 4、shRNA-IRF-3-DC在細(xì)胞形態(tài)