慢性膽道感染對Oddi括約肌功能影響的初步研究.pdf

1、研究背景與目的
　　 臨床上,Oddi括約肌(sphincter of Oddi,SO)松弛在肝膽管結(jié)石患者比較常見,由于SO松弛可能誘發(fā)返流性膽管炎,從而使肝膽管結(jié)石復(fù)發(fā)增加,因此,SO松弛與否是術(shù)中是否廢棄SO行膽腸吻合的主要參考因素。但隨著膽腸吻合術(shù)后吻合口狹窄、癌變以及結(jié)石復(fù)發(fā)等遠期并發(fā)癥逐漸被認識,越來越多的研究者提出盡可能地保留SO的結(jié)構(gòu)和功能并恢復(fù)膽道的正常生理結(jié)構(gòu),這一觀點的提出使得一些研究者致力于弄清肝膽管結(jié)石

2、患者SO松弛的發(fā)生原因。但迄今為止SO松弛的病因不明,學(xué)術(shù)界對肝膽管結(jié)石患者SO松弛的原因存在較大爭議,一部分研究者認為排石過程對SO組織的機械性損傷是SO松弛的主要原因,另一部分研究者卻發(fā)現(xiàn)SO松弛與否和可能存在的排石過程并無密切關(guān)系。
　　 炎性腸道病變和非結(jié)石性膽囊炎引起的平滑肌功能變化是近年來消化系統(tǒng)功能學(xué)研究的熱點之一。炎癥狀態(tài)下平滑肌運動功能減弱與活性氧簇和亞硝酸鹽等炎癥代謝產(chǎn)物對平滑肌細胞膜的損害有密切關(guān)系,表現(xiàn)為

3、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡,肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)磷酸化障礙甚至纖絲狀肌動蛋白(filamentous actin,F-actin)發(fā)生重塑。這些研究結(jié)果強烈的提示我們反復(fù)發(fā)作的膽道感染可能與肝膽管結(jié)石患者SO松弛有著密切的關(guān)系。但關(guān)于慢性膽道感染對SO功能有何影響目前尚未見相關(guān)報道。
　　 基于以上背景,我們推測:反復(fù)發(fā)作的膽道感染可能是SO平滑肌收縮功能減弱的重要原因。為驗證我們的假說,本研究旨在通

4、過臨床研究,觀察SO松弛患者的SO壓力和肌電活動特征,分析肝膽管結(jié)石患者SO松弛的主要危險因素。隨后通過建立兔膽道感染的動物模型,研究慢性膽道感染對兔在體和離體SO肌電活動的影響;最后從細胞水平闡明慢性膽道感染后SO平滑肌細胞收縮相關(guān)的鈣離子動員、MLC磷酸化、F-actin重塑的發(fā)生情況。
　　 材料與方法
　　 一、采用環(huán)狀電極記錄肌電和三通道測壓導(dǎo)管測壓的方法,我們記錄了肝膽管結(jié)石患者SO松弛時的SO壓力和肌電特征

5、,分析其SO基礎(chǔ)壓(SO basal pressure,SOBP)、峰壓(SO amplitude,SOAP)和收縮持續(xù)時間(duration of SO contraction)、收縮頻率(frequency of SO phasic contraction,SOF)以及SO肌電幅值(amplitude of SO spikeburst,SOSB)的變化情況。進一步,采用多因素分析回顧性研究293例肝膽管結(jié)石患者SO松弛的發(fā)生情況,分

6、析年齡、性別、病程、結(jié)石分布、結(jié)石大小、結(jié)石性狀、既往手術(shù)次數(shù)、手術(shù)方式以及既往膽管炎發(fā)作次數(shù)等因素與SO松弛的相關(guān)性。
　　 二、用改良的Thomas法建立清醒狀態(tài)下兔SO功能檢測的動物模型,在清醒狀態(tài)下記錄兔SO的肌電活動,分析消化間期、靜脈給予不同劑量的CCK和進食后SO肌電的變化情況。
　　 三、用膽總管內(nèi)置絲線和經(jīng)膽囊管連續(xù)3周(每周1次)向膽總管內(nèi)注入大腸桿菌的方法建立慢性膽道感染的動物模型,以對照組和非感染

7、組為對照,采用一般情況(飲食量、肛溫、體重變化)、SO病理檢測評分和肝功能檢測的方法對模型進行判斷。在模型終點進行在體和離體SO肌電記錄,對慢性膽道感染組、對照組和非感染組的肌電活動進行比較。在體SO肌電記錄分別比較在消化間期、靜脈給予不同劑量的CCK后各組SO的肌電變化情況,分析慢性膽道感染對SO肌電活動的影響。離體實驗采用完整切取SO組織、在離體器官浴槽中記錄SO肌電活動的方法進行,比較各組SO在基礎(chǔ)狀態(tài)、CCK誘發(fā)的SO肌電頻率、

8、幅值變化情況,進一步,我們研究了在激動劑[60 mM KC1,50 nM ionomycin,10 nM cholecystokinin(CCK)]作用下和容量依賴的鈣離子內(nèi)流(capacitative calcium entry,CCE)誘導(dǎo)下胞外鈣離子內(nèi)流和胞漿內(nèi)鈣池鈣離子釋放引發(fā)SO肌電活動的變化。
　　 四、為研究慢性膽道感染對平滑肌細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、MLC磷酸化及F-actin表達的影響,我們對對照組,非感染組和慢性膽道

9、感染組SO平滑肌細胞進行了原代分離和培養(yǎng),首先用Fluo-3 AM負載后在激光共聚焦顯微鏡下觀察激動劑(60 mM KC1,50 nM ionomycin,10 nM CCK)和CCE對胞漿內(nèi)[Ca2+]i的影響,然后用Western-blot方法檢測SO平滑肌組織中MLC磷酸化水平的改變,最后檢測了FITC-phalloidin標記的平滑肌細胞骨架F-actin的表達情況。
　　 結(jié)果
　　 一、293例肝膽管結(jié)石患者

10、中伴發(fā)SO松弛60例(20.5％),與SO不松馳的患者相比較,其SO基礎(chǔ)壓、峰壓、收縮頻率和收縮持續(xù)時間降低,SO肌電幅值和頻率也相應(yīng)降低。肝膽管結(jié)石的病程和多次發(fā)作的急性膽管炎與SO松弛的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 二、建立了清醒狀態(tài)下SO肌電檢測的動物模型。禁食期間,SO的肌電活動呈周期性變化,肌電活動由較弱的1期經(jīng)逐漸升高的2期過渡至肌電活動最強的第3期,4期為3期向1期的短暫過渡期。20ng·kg-1和100ng·kg-1的C

11、CK以及進食可以明顯興奮SO的肌電活動。
　　 三、建立了慢性膽道感染的動物模型,慢性膽道感染后γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltransferase,GGT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的明顯升高,SO組織在病理上表現(xiàn)為黏膜層、肌層炎細胞浸潤和肌層膠原纖維沉積增多,炎癥評分明顯增高。慢性膽道感染后SO肌電頻率、運動指數(shù)在2期、3期明顯減低,20 ng·kg-1和100 ng·kg-1的

12、CCK興奮SO肌電活動的作用減弱。同樣,慢性膽道感染后靜息狀態(tài)及10 nM CCK誘導(dǎo)下離體SO肌電活動明顯減低,促進胞外鈣離子內(nèi)流和胞內(nèi)鈣離子釋放的激動劑誘發(fā)的肌電活動也明顯減弱。
　　 四、利用膠原酶消化法,我們對兔SO平滑肌細胞進行了分離和培養(yǎng)。慢性膽道感染后,兔SO平滑肌細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡,包括KCl、CCE誘發(fā)的胞外鈣離子內(nèi)流和CCK、Caffeine誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子釋放減少。此外,MLC磷酸化障礙、F-actin骨架

13、重塑在慢性膽道感染后SO平滑肌細胞也有發(fā)生。
　　 結(jié)論
　　 一、肝膽管結(jié)石患者SO松弛的發(fā)生率較高,其運動特征為SO肌電活動減弱和壓力降低,病程和多次發(fā)作的膽管炎是SO松弛的主要危險因素。
　　 二、慢性膽道感染后兔在體及離體SO肌電頻率、幅值和運動指數(shù)均明顯降低,其對CCK等激動劑的反應(yīng)減弱。
　　 三、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、MLC磷酸化障礙、F-actin表達下降可能是慢性膽道感染后SO平滑肌運動功能減