膽總管末端支架植入對(duì)Oddi括約肌和膽道壓力影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：
　　 目前，不論是通過(guò)外科的、經(jīng)皮的或者經(jīng)內(nèi)窺鏡方式的膽道引流，已經(jīng)成為姑息治療不可切除的惡性低位膽道梗阻的重要手段。特別是微創(chuàng)的經(jīng)皮經(jīng)肝或經(jīng)內(nèi)窺鏡的膽道支架植入，在緩解黃疸癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期方面起到了積極的作用。然而，術(shù)后腸膽返流所致的支架堵塞和返流性膽管炎卻一直影響著該項(xiàng)治療的實(shí)際效果。因此，支架的開(kāi)通就成為影響生存質(zhì)量和治療費(fèi)用的重要因素。膽總管末端支架是否跨越壺腹部即Oddi括約肌(sphincter

2、 of Oddi，SO)功能的保留與否，也一直受到爭(zhēng)議。
　　 以往人們大多將研究焦點(diǎn)集中在膽總管末端植入支架后腸膽返流和支架梗阻的相關(guān)因素上，但支架對(duì)于SO及膽道壓力的影響機(jī)制還不清楚。而且，膽總管末端支架植入后SO組織結(jié)構(gòu)的變化以及腸膽返流的發(fā)生與程度也鮮有報(bào)道。因此，有必要從支架植入后膽道壓力變化、SO組織病理學(xué)改變和腸膽返流的發(fā)生等方面對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行深入的研究。
　　 本研究中，應(yīng)用膽道測(cè)壓、膽汁中99mTc-D

3、TPA放射性活度與胰酶含量測(cè)定等方法，對(duì)動(dòng)物模型及低位膽道?；颊咧Ъ苤踩肭昂蟮哪懙缐毫εc腸膽返流進(jìn)行對(duì)比觀察，并結(jié)合支架植入前后血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的變化，探討支架植入后膽道壓力的變化機(jī)制以及腸膽返流與返流性膽管炎的發(fā)生和原因。同時(shí)，應(yīng)用VG染色和免疫組化的方法，觀察動(dòng)物模型膽總管末端支架植入后SO的病理變化，探討一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)和血管活性腸肽(vasoactiveintestinal

4、 peptide，VIP)在SO組織中表達(dá)的變化和意義。從而進(jìn)一步揭示膽總管末端支架植入后膽道壓力和SO功能、組織病理變化的特性和機(jī)制，為腸膽返流所致的支架梗阻和膽道感染等并發(fā)癥的防治開(kāi)辟新的途徑。
　　 材料與方法：
　　 一、動(dòng)物模型膽道壓力變化的研究1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選取由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康成年實(shí)驗(yàn)犬6只(雄性4只，雌性2只)，年齡2-4歲，體重22.5-30Kg。對(duì)實(shí)驗(yàn)犬膽總管末端支架植

5、入前后相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行自身對(duì)照比較。
　　 2、儀器和設(shè)備(1)SHIMADZU SDU-500C型超聲診斷儀及SHIMADZU2400(α)DSA設(shè)備。
　　 (2)PC polygram HR高分辨、多通道胃腸功能測(cè)定儀及相應(yīng)測(cè)壓軟件、三通道測(cè)壓導(dǎo)管、低順應(yīng)性水灌注系統(tǒng)。
　　 (3)日立7170A生化分析儀。
　　 3、支架植入
　　 實(shí)驗(yàn)犬在禁食水24小時(shí)后，經(jīng)肌肉注射速眠新Ⅱ1.5-3.0m

6、l行全身麻醉。首先在超聲引導(dǎo)下確定膽囊位置，于超聲監(jiān)視下以5.0Fr膽道套管穿刺針經(jīng)皮經(jīng)肝穿刺膽囊，成功后在0.035inch導(dǎo)絲引導(dǎo)下將穿刺針外套管經(jīng)膽囊管送入膽總管內(nèi)，并留取膽汁10ml。在加硬導(dǎo)絲引導(dǎo)下，置換5.0Fr20cm動(dòng)脈鞘于十二指腸內(nèi)。沿動(dòng)脈鞘插入測(cè)壓導(dǎo)管至十二指腸遠(yuǎn)端內(nèi)6-8cm，同時(shí)將動(dòng)脈鞘退至膽總管上端，然后回撤導(dǎo)管測(cè)壓。待測(cè)壓后，在DSA透視下經(jīng)由動(dòng)脈鞘于膽總管末端行支架植入，支架為3mm×25mm的編織鎳鈦合金

7、支架(北京安泰公司)，其遠(yuǎn)端5-10mm位于十二指腸內(nèi)。抽盡膽囊膽汁，拔除動(dòng)脈鞘后結(jié)束。術(shù)后給予青霉素160萬(wàn)U肌注，并繼續(xù)禁食水24小時(shí)。5-6周后重復(fù)上述方法穿刺膽囊、留取膽總管膽汁，并插入測(cè)壓導(dǎo)管經(jīng)支架內(nèi)送入十二指腸遠(yuǎn)端，回撤導(dǎo)管進(jìn)行測(cè)壓。
　　 4、測(cè)壓方法
　　 設(shè)置電腦測(cè)壓系統(tǒng)參數(shù)，水流速度為0.5ml/min，連接測(cè)壓導(dǎo)管。待基線平穩(wěn)后，勻速后拽導(dǎo)管經(jīng)由壺腹部至膽總管內(nèi)行測(cè)壓并存儲(chǔ)曲線。
　　 二、

8、動(dòng)物模型SO組織變化的研究1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象從膽總管末端支架植入前后成功測(cè)壓的5只實(shí)驗(yàn)犬中隨機(jī)選取4只，作為病理學(xué)檢查的實(shí)驗(yàn)組。再?gòu)闹袊?guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心隨機(jī)選取健康成年實(shí)驗(yàn)犬3只(雌雄不限，年齡2-4歲，體重22.5-30Kg)，作為對(duì)照組。
　　 2、藥品和器材(1)一抗：血管活性腸肽抗體，一氧化氮合酶(誘導(dǎo)型)抗體；二抗：山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。
　　 (2)5％BSA封閉液，SABC

9、，復(fù)合消化液，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。
　　 (3)C-7070/BX41采集圖像系統(tǒng)(Olympus，JP)。
　　 (4)MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)(Universal Imaging Corporation，USA)。
　　 3、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)犬經(jīng)肌肉注射速眠新Ⅱ行全身麻醉。在無(wú)菌條件下經(jīng)腹正中切口開(kāi)腹，并逐層進(jìn)入腹腔。夾閉十二指腸兩端，游離膽總

10、管，將含有支架的膽總管、壺腹部及一部分十二指腸一并取下。分離并留取壺腹部組織，放到4%多聚甲醛內(nèi)固定。
　　 (2)VG特殊染色：標(biāo)本用甲醛浸泡，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片；切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇后直至流水沖洗2min；蘇木素染色15min，流水沖洗2min；鹽酸乙醇分化10s(提插數(shù)下)；流水沖洗30min；VG染液染色5min；小心的用吸水紙將染液洗干，避免磨損組織；乙醇、二甲苯快速的脫水、透明，最后中性樹(shù)脂封片固定

11、。
　　 (3)免疫組化：新鮮組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，65℃烤25min；常規(guī)脫蠟至水；30%H2O2滅活內(nèi)源性活化酶，浸泡10min后，蒸餾水洗3次；熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M構(gòu)椽酸鹽緩沖液(PH6.0)，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10min后，反復(fù)2次。冷卻后PBS洗滌2次；滴加5%BSA封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗兔IgG，4℃過(guò)夜，PBS洗滌

12、；滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20min，PBS洗；0.05%DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，流水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，樹(shù)脂封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。
　　 4、結(jié)果判斷
　　 觀察NOS和VIP時(shí)，均以壺腹部SO平滑肌細(xì)胞、粘膜柱狀上皮細(xì)胞和粘膜下結(jié)締組織細(xì)胞的胞核藍(lán)色，胞質(zhì)棕黃色染色為陽(yáng)性。每張切片選擇5個(gè)視野，用40×物鏡觀察采集圖像。對(duì)于每張圖像，應(yīng)用MetaM

13、orph和C-7070/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其陽(yáng)性區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density，IOD)。
　　 三、腸膽返流的研究1、受試對(duì)象隨機(jī)選取2008年4月至2009年1月間，因惡性低位梗阻性黃疸在中國(guó)醫(yī)大附屬盛京醫(yī)院介入病房住院治療的患者16例(男性8例、女性8例)，年齡為51-86歲(平均69.63±9.16歲)。其中膽管癌4例、胰頭癌5例、壺腹癌5例、轉(zhuǎn)移癌2例。術(shù)前所有患者沒(méi)

14、有膽道感染的臨床癥狀和體征，并排除腸梗阻及腸道手術(shù)病史。所有患者均通過(guò)經(jīng)皮經(jīng)肝膽管穿刺的方式，于膽總管末端植入金屬網(wǎng)狀支架。共植入17枚支架(15例各植入1枚，1例植入2枚)，直徑為10mm，長(zhǎng)度為50-80mm。在植入支架前進(jìn)行血常規(guī)、血液生化檢查和膽汁中胰酶含量的檢測(cè)。在支架植入后2-5天(平均3.25±0.86天)進(jìn)行上述各項(xiàng)指標(biāo)和膽汁中放射性活度的檢測(cè)。
　　 2、支架植入
　　 患者在超聲引導(dǎo)下，以5.0Fr

15、DLPN膽道穿刺針行經(jīng)皮經(jīng)肝膽道穿刺。成功后，在DSA監(jiān)視下，應(yīng)用導(dǎo)絲引導(dǎo)于梗阻部位近端置入6.0-8.0Fr的外引流管，行單純外引流。待黃疸消退，經(jīng)原有膽道外引流通路于膽道梗阻部位植入金屬網(wǎng)狀支架。并將引流管置于支架近端內(nèi)l-2cm或其上端膽道內(nèi)。術(shù)后2-5天內(nèi)試驗(yàn)閉管并觀察后，行經(jīng)外引流管的膽道造影確認(rèn)，口服核素并留取膽汁后拔管。
　　 3、膽汁中核素的檢測(cè)所有患者于造影拔管前禁食一夜。拔管前經(jīng)造影確認(rèn)引流管位置后，口服1m

16、l含有185MBq(5mCi)核素99mTc-DTPA的水，接著250ml溫水漱服，立即平臥位，經(jīng)膽道引流管收集接下來(lái)2h的膽汁，取其中的20ml，采用RM905型放射活度檢測(cè)儀計(jì)數(shù)放射性活度。測(cè)量之前測(cè)定本底的放射性活度，再測(cè)量裝有待測(cè)膽汁的注射器內(nèi)的放射性活度，兩者的差值為最終膽汁內(nèi)放射性活度。如果膽汁中可以檢測(cè)到放射性活度，則認(rèn)為該患者存在十二指腸膽道返流。
　　 4、膽汁胰酶含量的檢測(cè)膽道單純外引流1-2天后，膽汁性狀良

17、好時(shí)留取20ml，進(jìn)行支架植入前的膽汁脂肪酶和淀粉酶含量的檢測(cè)。支架植入后，于拔管前經(jīng)造影確認(rèn)引流管位置后，留取膽汁20ml行胰酶含量檢測(cè)。
　　 5、血常規(guī)和血液生化檢查于膽道穿刺引流前及支架植入后拔管前，分別檢測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比以及血液生化中總膽紅素和直接膽紅素含量。
　　 四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理對(duì)實(shí)驗(yàn)所獲得的計(jì)量資料結(jié)果，符合正態(tài)分布的，以mean±SD表示，并采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；不符合正態(tài)分布

18、的，則計(jì)算其中位數(shù)和25%、75%可信區(qū)間，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、動(dòng)物模型膽道壓力變化的研究1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6只實(shí)驗(yàn)犬全部一次穿刺成功，并于測(cè)壓后植入支架。其中1只植入支架后5周發(fā)現(xiàn)支架脫落，再次植入支架時(shí)因膽汁瘺而死亡；其他5只均于觀察時(shí)間內(nèi)再次穿刺、測(cè)壓，并健康存活。
　　 2、膽道壓力
　　

19、 膽總管末端支架植入前測(cè)得SOBP、CBDP、SOCA、SOD分別為：13.69±4.29mmHg、12.98±2.86mmHg、42.65±8.50mmHg、6.69±1.46s；支架植入5-6周后分別為：10.58±3.98mmHg、7.43±2.20mmHg、31.95±9.00mmHg、4.47±1.21s。其中SOBP和CBDP均高于DP，SOBP較支架植入前有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而CBDP明顯低于支架植入

20、前，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。SOCA較支架植入前降低；SOD相比支架植入前縮短。SOCA和SOD與支架植入前相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3、腸膽返流
　　 膽總管末端支架植入5-6周后，膽總管膽汁中的脂肪酶和淀粉酶含量分別為9.50±4.80U/L和43.00±6.48U/L，與支架植入前相比均沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 二、動(dòng)物模型SO組織變化的研究1、VG特殊

21、染色光鏡下觀察(10×物鏡)，VG染色后平滑肌呈黃色，膠原纖維和結(jié)締組織呈紅色。膽總管末端植入支架后的實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組比較，可見(jiàn)SO有以下病理改變：
　　 (1)纖維化：輕度者可見(jiàn)平滑肌中已含有少量膠原和結(jié)締組織纖維。而重度者則可發(fā)現(xiàn)肌肉組織僅呈孤立小島狀，很難發(fā)現(xiàn)肌纖維束，周圍大量膠原纖維和結(jié)締組織，并伴有透明變性。
　　 (2)腺體病變：可見(jiàn)腺體呈囊狀擴(kuò)張，腺肌病變即腺體進(jìn)入平滑肌纖維及膠原纖維組織中被環(huán)繞。

22、>　　 (3)炎性病變：表現(xiàn)為炎性浸潤(rùn)，即腺體、肌肉和結(jié)締組織間有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2、免疫組化
　　 (1)壺腹部SO粘膜層中NOS和VIP的IOD變化：實(shí)驗(yàn)組的NOS和VIP的IOD中位數(shù)分別為18.87和101.18，與對(duì)照組相比雖有增加趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)壺腹部SO粘膜下層和粘膜肌層中NOS和VIP的IOD變化：實(shí)驗(yàn)組的NOS和VIP的IOD中

23、位數(shù)分別為17.34和45.23，與對(duì)照組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (3)壺腹部SO肌層中NOS和VIP的IOD變化：實(shí)驗(yàn)組的NOS和VIP的IOD分別為12.18±5.87和77.85±51.75，與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 三、腸膽返流的研究1、受試對(duì)象16例患者中，支架植入后有1例脫管、1例膽汁未引出而沒(méi)有進(jìn)行拔管前膽汁中放射性活度和胰酶含量的檢測(cè)；其他14例患者均成功地

24、進(jìn)行了膽汁中放射性活度和胰酶含量的測(cè)定。
　　 2、腸膽返流
　　 在14例患者中有85.71%的患者(12/14例)2小時(shí)膽汁中檢測(cè)到99mTc的放射性活度，所檢測(cè)到的放射計(jì)數(shù)為3.36±2.82MBq，占總攝入劑量的1.82%。
　　 支架植入前，測(cè)得膽汁中脂肪酶和淀粉酶含量的中位數(shù)分別為21.25U/L和10.5U/L。支架植入后，膽汁中脂肪酶和淀粉酶含量明顯升高，其中位數(shù)分別達(dá)到了5902.45U/L和2

25、991U/L，與支架植入前相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 3、血常規(guī)和血液生化在14例患者中，支架植入后均沒(méi)有出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)、黃疸加重等膽管炎表現(xiàn)。外周血中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)為7.59±2.62×109/L，中性粒細(xì)胞百分比的中位數(shù)為73.55%，與支架植入前相比都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 支架植入前，血液生化中的總膽紅素和直接膽紅素值分別為216.84±138.05umol/L和168.55±

26、103.28umol/L。支架植入后，總膽紅素和直接膽紅素值明顯下降，分別為118.24±91.79umol/L和94.48±68.45umol/L，與支架植入前相比都具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、動(dòng)物模型膽總管末端支架植入5-6周后，SO運(yùn)動(dòng)功能的減弱以緊張性收縮的減弱為主，而基礎(chǔ)性收縮仍然存在。CBDP雖然下降，但仍高于正常的DP，并保持與之的壓力梯度，抑制了腸膽返流的發(fā)生。