骨重塑在造血干細(xì)胞動(dòng)員中的機(jī)制及應(yīng)用研究.pdf

1、本研究分為兩部分：
　　 第一部分：
　　 目的：骨髓中大多數(shù)造血干細(xì)胞位于骨組織構(gòu)成的骨盒中。成骨細(xì)胞是骨內(nèi)膜表面的內(nèi)襯細(xì)胞，生理?xiàng)l件下HSC及移植后歸巢至骨髓的HSC與之密切接觸，這種解剖定位提示成骨細(xì)胞可能調(diào)節(jié)HSC的功能。這一觀點(diǎn)首先在成骨細(xì)胞和HSC的體外共培養(yǎng)中得到證實(shí)，隨即一系列的研究幾乎同時(shí)確定:成骨細(xì)胞是HSC完中一關(guān)鍵組成成分，目前人們將之命名為‘成骨細(xì)胞盒’或‘骨內(nèi)膜完’。通過調(diào)節(jié)‘骨內(nèi)膜完’的大小

2、，可以控制HSC的數(shù)量，維持HSC的穩(wěn)定狀態(tài)’。本研究以干細(xì)胞動(dòng)員中的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察干細(xì)胞動(dòng)員過程中成破骨細(xì)胞數(shù)量和功能的變化及其與動(dòng)員的關(guān)系，進(jìn)一步研究造血干細(xì)胞動(dòng)員的機(jī)制。
　　 方法：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)動(dòng)員0,3,5天小鼠外周血干細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)動(dòng)員效果;通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法比較動(dòng)員0,3,5天小鼠成骨細(xì)胞特異性基因OCN,OPN,SDF-1,SCF的水平;并通過免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)比較動(dòng)員0,3,5

3、天人類及小鼠成骨細(xì)胞數(shù)量功能的差異:利用細(xì)胞化學(xué)TRACP染色的方法比較動(dòng)員0,3,5天小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量和功能的差異;利用連續(xù)切片標(biāo)記Caspase3的方法檢測(cè)人類及小鼠成骨細(xì)胞的凋亡情況;利用ELISA的方法檢測(cè)人類及小鼠循環(huán)中OCN,TRAP-5b蛋白水平反應(yīng)成破骨細(xì)胞活性;共培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞和小鼠骨髓有核細(xì)胞，檢測(cè)成骨細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.短期應(yīng)用G-CSF可導(dǎo)致人類和小鼠動(dòng)員模型中干髓端成骨細(xì)胞數(shù)量

4、減少活性下降:動(dòng)員前小鼠成骨細(xì)胞OCNmRNA水平為動(dòng)員第三天的27±6倍(0.0l);且動(dòng)員后第3天骨內(nèi)膜成骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)由立方形變?yōu)樗笮?CD45-Terl19-OPN"成骨細(xì)胞數(shù)量在動(dòng)員后3天及5天明顯減少(動(dòng)員前，4085±135cells/femur;動(dòng)員后3天，1118±80cells/femur;動(dòng)員后5天，1032±55cells/femur;P=0.02);動(dòng)員3天和5天成骨細(xì)胞活性明顯下降，OCN水平分別為

5、59.44±3.16ng/ml(動(dòng)員前)，39.21±4.49ng/ml(動(dòng)員后第3天)，42.36±2.23ng/ml(動(dòng)員后第5天)，f0.O1。進(jìn)一步檢測(cè)正常供者和自體移植患者標(biāo)本同樣顯示動(dòng)員后成骨細(xì)胞數(shù)量減少并伴有活性下降。然而在小鼠G-CSF動(dòng)員第3天外周血LSK細(xì)胞比例并未明顯增加，動(dòng)員前、動(dòng)員3天及動(dòng)員5天分別為0.40±07％,0.55±0.05％和2.9±0.32％，因此成骨細(xì)胞的變化發(fā)生于動(dòng)員之前。
　　 2

6、.成骨細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致SDF-1,SCF,OPN等蛋白表達(dá)的減少，動(dòng)員前小鼠成骨細(xì)胞SDF-1mRNA的表達(dá)水平為動(dòng)員后員的發(fā)生。3天的3.44±0.3倍，進(jìn)而引起動(dòng).
　　 3.G-CSF誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞數(shù)量減少功能下降部分是由于動(dòng)員過程中成骨細(xì)胞發(fā)生了凋亡，但成骨細(xì)胞的分化并未受到抑制，供者血清DKKl水平在動(dòng)員前和動(dòng)員后5天并無明顯差異，13621.13±1081.99pg/ml和10079.83±2055.82pg/ml,

7、P=0.220。
　　 4.共培養(yǎng)成骨細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，加或不加G-CSF兩組成骨細(xì)胞OCNmRNA表達(dá)情況無明顯差別，0.69oCr-CSF通過間接途徑抑制成骨細(xì)胞。
　　 5.動(dòng)員后3天供者(動(dòng)員前5.04±0.43U/L，動(dòng)員后3天3.45±0.37U/L,0.03)及小鼠(動(dòng)員前5.43±1.2U/L，動(dòng)員后3天4.04±0.86U/L,P=0.47)血清TRAP-5b水平稍有下降，隨后血清TRAP-5b水

8、平明顯上升(供者動(dòng)員前為5.04±0.43U/L，動(dòng)員后5天為6.87±0.57U/L,P-'-0.04;小鼠動(dòng)員前5.43±1.2U/L，小鼠動(dòng)員后5天13.0611.65,P=0.02)。動(dòng)員過程中破骨細(xì)胞的活性逐漸增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：動(dòng)員過程中成骨細(xì)胞數(shù)量活性的下降導(dǎo)致了動(dòng)員的發(fā)生，并伴隨有破骨細(xì)胞的活化。
　　 第二部分：
　　 目的：造血干細(xì)胞移植不僅是惡性血液病、嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病及部分實(shí)體腫瘤主要甚至

9、唯一的治愈手段，而且隨著對(duì)干細(xì)胞及其細(xì)胞和組織工程研究的深入，正逐漸應(yīng)用到心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域。
　　 我們?cè)诘谝徊糠值难芯恐凶C明了骨重塑在造血干細(xì)胞動(dòng)員過程中發(fā)揮了重要的作用，在第二部分的研究中我們用6種小鼠模型模擬臨床上的自體干細(xì)胞移植過程，研究應(yīng)用甲狀旁腺激素(PTH)或NF-KB配體的受體(RANKL)靶向于成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞是否能夠增加干細(xì)胞數(shù)量，保護(hù)干細(xì)胞造血重建的功能。
　　 方法：利用細(xì)胞毒藥

10、物CTX處理小鼠，建立貧動(dòng)員模型，進(jìn)行造血干祖細(xì)胞培養(yǎng)，比較正常動(dòng)員和貧動(dòng)員小鼠模型中干細(xì)胞功能，并利用流式計(jì)數(shù)、RQ-PCR,ELISA的方法檢測(cè)貧動(dòng)員小鼠成骨細(xì)胞數(shù)量和功能。模擬臨床自體移植過程，用PTH,RANKL干預(yù)貧動(dòng)員小鼠〔具體分組見材料與方法圖1)，利用競(jìng)爭(zhēng)性移植模型(CRA)檢測(cè)不同用藥組小鼠干細(xì)胞移植16周后外周血中CD45.2陽性細(xì)胞比例。
　　 結(jié)果：
　　 1.多次細(xì)胞毒藥物化療嚴(yán)重影響了成骨細(xì)胞

11、和造血干細(xì)胞功能:自體干細(xì)胞移植患者化療后血清OCN水平明顯下降(化療前:22.19±1.08ng/mL和化療后:16.08±2.12ng/mL,P=0.O1)，小鼠模型中同樣證明了上述觀點(diǎn)，成骨細(xì)胞數(shù)量在多次應(yīng)用細(xì)胞毒藥物小鼠中明顯減少，功能下降。且多次應(yīng)用細(xì)胞毒嚴(yán)重影響了造血干祖細(xì)胞功能。CTLs/Gs組小鼠集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為21.16±1.35U,和13.00±1.71U，正常未用藥小鼠為29.17±1.22U，三者相比P=0

12、.010。
　　 2.骨髓CRA結(jié)果顯示給予G-CSF支持的小鼠干細(xì)胞功能明顯下降((G組比CTL組，Pte.O1)。然而，應(yīng)用PTH后可顯著改善該組小鼠干細(xì)胞造血重建的功能(PTH組比G組，F(xiàn)RO.O1;PTH組比CTL組，P<0.05)。外周血CRA結(jié)果同樣證明應(yīng)用G-CSF支持治療的G組小鼠僅有極少數(shù)周血干細(xì)胞能進(jìn)行造血重建((G組比CTL組，F(xiàn)RO.05)。而應(yīng)用PTH的P+G組小鼠外周血干細(xì)胞造血重建的能力明顯增加(P

13、+G組比G組，f0.O1;P+G組比CTL組，P<0.05)。與CTL組或G組相比，P+R及P+R+G組周血干細(xì)胞同樣顯示出了更強(qiáng)的林髓系造血重建能力。RANKL同G-CSF一樣可有效地動(dòng)員骨髓中的造血干細(xì)胞(P+G組比P+R組，PLO.05)因此，應(yīng)用PTH和RANKL可增加小鼠模型中動(dòng)員至外周血中的造血干細(xì)胞數(shù)量并且保護(hù)多次應(yīng)用細(xì)胞毒藥物后造血干細(xì)胞功能。
　　 結(jié)論：靶向于骨兔的藥物可有效地改善多次應(yīng)用細(xì)胞毒藥物，尤其是聯(lián)