Ghrelin對地塞米松誘導胰島細胞凋亡的保護作用的研究.pdf

1、前言：
　　 糖皮質(zhì)激素是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenalHPA)軸的最終激素,是一種重要的胰島素拮抗激素。臨床上大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會引起糖耐量異常、胰島素抵抗,甚至發(fā)展為類固醇糖尿病(steroiddiabetesSD)。目前SD定義為內(nèi)源性皮質(zhì)醇增多或糖皮質(zhì)激素治療所致的繼發(fā)性糖尿病。國外研究認為長期使用糖皮質(zhì)激素的病人患糖尿病的風險度為1.5到2.5。
　　 目前的

2、研究認為SD的發(fā)病機制包括:①通過骨骼肌途徑(影響糖脂代謝);②通過肝臟途徑(影響糖脂代謝);③降低胰島素的釋放;④引起胰島細胞凋亡:國內(nèi)外對此報道罕見。研究認為糖皮質(zhì)激素可通過cAMP/PKA信號通路、PI3K/AKT信號通路、通過調(diào)節(jié)bcl-2/bax的比率及線粒體的去極化等途徑引起胰島細胞凋亡。而對于地塞米松是否可通過P38MAPK信號通路誘導胰島細胞凋亡和胰島細胞保護劑Ghrelin對地塞米松誘導胰島細胞凋亡是否具有保護作用及與

3、P38MAPK信號通路的關(guān)系國內(nèi)外未見報道。
　　 故本研究采用不同濃度不同時間Ghrelin作用于地塞米松誘導的胰島細胞后檢測細胞凋亡水平的變化,同時檢測地塞米松誘導胰島細胞凋亡是否可通過P38MAPK信號通路及此信號通路是否參與Ghrelin對胰島細胞凋亡保護作用。從而為糖皮質(zhì)激素對胰島細胞毒性作用的保護及類固醇性糖尿病的防治提供可靠的實驗依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 大鼠胰島

4、細胞株INS-1(10-30代);Ghrelin,地塞米松,SB203580(P38MAPK信號通路阻斷劑);Phospho-P38MAPK抗體;MTS凋亡檢測試劑盒,Annexin-V-FITC-PI雙染試劑盒。
　　 二、實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 大鼠胰島細胞株INS-1在RPMI1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。細胞單層生長達80-85%培養(yǎng)面積后,用于實驗或細胞

5、傳代。
　　 2、MTS凋亡檢測
　　 收集對數(shù)期細胞,以96孔板中不同濃度INS-1細胞接種數(shù),觀察作用3-4天確定最佳的細胞接種濃度。上述方法確定的最佳細胞接種濃度為1×104-4×104/孔,每孔中加入1×104個細胞,達到作用時間后,每孔中加入MTS試劑10ul,37℃孵育,1-4h內(nèi)在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長測定各孔OD值。每份標本均檢測3個復孔。
　　 3、AnnexinV-PI雙染,流式細胞儀分

6、析
　　 收集細胞,用PBS洗滌并取1×105個細胞,離心后棄上清,加入300ul緩沖液懸浮細胞。加入5ulAnnexinV-FITC混勻后,加入5ulPI混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15min。1小時內(nèi)流式細胞儀檢測。每份標本均檢測3個復孔。
　　 4、WesternBlot(免疫印記)
　　 應(yīng)用細胞裂解液提取細胞蛋白,測定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠,進行電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交。磷酸化P38MAPK上樣量為1

7、00ug。ECL發(fā)光法測定目的條帶,目的條帶的灰度值用ScionImage軟件分析。每份標本均檢測3個復孔。
　　 5、流式細胞儀檢測Phospho-P38MAPK含量
　　 收集細胞,使用甲醛溶液固定,甲醇穿孔,然后取5×105個細胞,離心棄上清,加入一抗孵育,離心棄上清,加入二抗孵育,離心棄上清,加入500ulPBS重懸,流式細胞儀上機檢測。每份標本均檢測3個復孔。結(jié)果采用WinMDI2.9軟件分析。
　　

8、6、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差,組間差異比較采用Dunnett's檢驗,P＜0.05差異有顯著性。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、Ghrelin對地塞米松誘導大鼠胰島β細胞凋亡的影響
　　 流式細胞儀檢測AnnexinV-PI雙染細胞分析與MTS檢測結(jié)果相似。即胰島細胞凋亡率在加入lnMGhrelin(43.53%)時與DEX組(46.

9、70%)無明顯差異(P＞0.05),從10nMGhrelin(27.95%)開始胰島細胞凋亡率明顯下降,在Ghrelin為100nM(9.05%)時胰島細胞凋亡率最低與空白對照組(8.17%)無明顯差異。
　　 二、Phospho-P38MAPK表達與Ghrelin拮抗地塞米松誘導胰島細胞凋亡的關(guān)系
　　 流式細胞儀及WesternBlot檢測結(jié)果:Phospho-p38MAPK含量DEX組明顯高于對照組及SB組、DEX

10、+SB組及DEX+Ghrelin組。同時SB組、DEX+SB組及DEX+Ghrelin組Phospho-p38MAPK蛋白水平表達基本相當。
　　 三、P38MAPK信號通路對Ghrelin拮抗地塞米松誘導胰島細胞凋亡率的影響
　　 MTS及流式細胞儀檢測胰島細胞凋亡率結(jié)果:DEX組較對照組胰島細胞凋亡率明顯增加;SB組細胞凋亡率與對照組無明顯差別,而凋亡率明顯低于DEX組:DEX+SB組較DEX組細胞凋亡率下降但仍高于