雄激素抗U18666A誘導細胞凋亡的保護作用研究.pdf

1、研究背景：年齡相關的雄激素水平下降與多種神經退行性疾病相關，包括阿爾茨海默病海默病(Alzheimer's Disease，AD)、焦慮抑郁癥、腦萎縮等。越來越多資料提示，雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)在此類疾病的預防與治療中具有廣泛的神經生物學作用，有助于抑制疾病病理損傷、修復損傷的神經元、突觸可塑性修復等神經保護效應。目前關于雄激素神經保護作用機制研究較少，主要包括:(1)調節(jié)腦內β-淀粉樣蛋白釋放;(2

2、)抗氧化應激;(3)抗凋亡作用;(4)促進神經元生長、分化。進一步闡明雄激素的神經保護作用及其分子作用機制，可能為我們探索預防與治療神經退行性疾病的新方法提供非常重要的理論與臨床依據(jù)。
　　研究目的：本研究采用C6細胞作為體外神經膠質細胞研究模型，利用U18666A誘發(fā)C6細胞凋亡活動、LY294002抑制PI3K/Akt信號通路，觀察PI3K/Akt信號通路在雙氫睪酮(DHT)抗U18666A誘導的C6細胞凋亡活動的作用及其分子

3、機制。從而進一步探討PI3K/Akt信號通路在雄激素抗U18666A誘發(fā)C6細胞凋亡作用中的意義。
　　研究方法：
　　第一部分：通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術、Hochest33342染色檢測法，分別定量和定性檢測不同濃度的U18666A對C6細胞凋亡活動的形態(tài)學變化影響。
　　第二部分：通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術、Hochest33342染色檢測法從形態(tài)學上觀察DHT對

4、U18666A誘導C6細胞凋亡的保護作用，以及LY294002對DHT凋亡保護的阻斷作用。
　　第三部分：利用Western Blot檢測法，觀察DHT對Akt磷酸化激活作用，以及LY294002對DHT的Akt磷酸化激活作用的影響。此外，我們還進一步利用Western Blot檢測法定量觀察DHT、LY294002對凋亡相關蛋白Seladin-1、Bcl-2家族、IAP家族、Caspase-3表達變化的影響，探討PI3K/Akt

5、信號通路及其下游凋亡相關分子Seladin-1、BCL-XL、Bax、Survivin、Caspase-3表達的變化在雄激素抗U18666A凋亡作用中的分子機制。
　　研究結果：
　　第一部分：免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在熒光顯微鏡微鏡下發(fā)現(xiàn)U18666A能顯著誘導C6細胞凋亡發(fā)生，凋亡細胞數(shù)量明顯增加。
　　通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術定量檢測發(fā)現(xiàn)，相較空白對照組，不同濃度(0.5μ g/ml，1.0

6、μ g/ml，2.5μ g/ml)的U18666A處理能夠顯著增加C6細胞的總凋亡率(P＜0.05)。上述結果提示，不同濃度的U18666A（實驗采用）能夠顯著誘導C6膠質細胞發(fā)生凋亡活動。
　　第二部分：為了觀察DHT對U18666A誘導C6膠質細胞亡活動的形態(tài)學影響，我們用DHT（10-2μM）預處理1h后給予U18666A(1.0μ g/ml)刺激48h，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)C6細胞凋亡細胞數(shù)量明顯減少，而PI3K抑制劑LY2

7、94002(50μ M)預處理2h后發(fā)現(xiàn)DHT的抗凋亡作用明顯被抑制。
　　此外，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，與U18666A處理組相比，DHT預處理可以明顯降低U18666A誘導的C6細胞總凋亡率(P＜0.05)，而PI3K抑制劑LY294002(50μ M)可以抑制DHT的抗凋亡活動(P＜0.05)。上述結果提示，DHT可以明顯阻斷U18666A誘導的C6細胞凋亡活動，而PI3K阻斷劑可以明顯抑制DH

8、T的抗凋亡保護作用。
　　第三部分：首先我們利用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，與U18666A處理組比較，DHT處理后C6細胞的磷酸化Akt表達量顯著升高(P＜0.05)，而LY294002預處理后能夠顯著抑制調DHT誘導的磷酸化Akt水平升高(P＜0.05)。上述結果提示，DHT可以明顯激活C6細胞的Akt磷酸化活動，而PI3K阻斷劑可以明顯抑制DHT的Akt激活效應。
　　此外，我們進一步利用Western Blot

9、檢測發(fā)現(xiàn):
　　1)與空白組比較，U18666A可以明顯下調凋亡保護蛋白Seladin-1表達(P＜0.05)，上調促凋亡蛋白Caspase-3表達(P＜0.05);
　　2)與U18666A處理組對比發(fā)現(xiàn)，DHT預處理后可以明顯上調凋亡保護蛋白Seladin-1、Survivin、BCL-XL表達(P＜0.05)，下調促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表達(P＜0.05)。
　　3)與DHT處理組(DHT+U186

10、66A)比較，PI3K阻斷劑LY294002可以明顯抑制DHT誘導的促凋亡蛋白Caspase-3、Bax下調表達(P＜0.05)，以及抑制DHT誘導的Seladin-1、Survivin、BCL-XL上調表達(P＜0.05)。
　　研究結論：根據(jù)上述實驗結果，在C6細胞模型上，我們發(fā)現(xiàn):
　　1)從凋亡形態(tài)學上我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的U18666A均可以明顯誘導體外培養(yǎng)的C6細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。上述結果提示，U18666A對C6膠

11、質細胞具有促凋亡作用。
　　2)從凋亡形態(tài)學上我們發(fā)現(xiàn)，DHT具有明顯的抗U18666A誘導的C6細胞凋亡效應，而PI3K抑制劑LY294002可以明顯阻斷DHT抗凋亡保護作用，我們的結果證明，PI3K/Akt信號通路參與了DHT抗U18666A誘導的C6細胞凋亡效應作用。
　　3)此外，我們發(fā)現(xiàn)DHT可以顯著上調凋亡保護蛋白Seladin-1、BCL-XL、Survivin表達，下調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達