雄激素抗U18666A誘導(dǎo)細胞凋亡的保護作用研究.pdf

1、研究背景：年齡相關(guān)的雄激素水平下降與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，包括阿爾茨海默病海默病(Alzheimer's Disease，AD)、焦慮抑郁癥、腦萎縮等。越來越多資料提示，雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)在此類疾病的預(yù)防與治療中具有廣泛的神經(jīng)生物學(xué)作用，有助于抑制疾病病理損傷、修復(fù)損傷的神經(jīng)元、突觸可塑性修復(fù)等神經(jīng)保護效應(yīng)。目前關(guān)于雄激素神經(jīng)保護作用機制研究較少，主要包括:(1)調(diào)節(jié)腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白釋放;(2

2、)抗氧化應(yīng)激;(3)抗凋亡作用;(4)促進神經(jīng)元生長、分化。進一步闡明雄激素的神經(jīng)保護作用及其分子作用機制，可能為我們探索預(yù)防與治療神經(jīng)退行性疾病的新方法提供非常重要的理論與臨床依據(jù)。
　　研究目的：本研究采用C6細胞作為體外神經(jīng)膠質(zhì)細胞研究模型，利用U18666A誘發(fā)C6細胞凋亡活動、LY294002抑制PI3K/Akt信號通路，觀察PI3K/Akt信號通路在雙氫睪酮(DHT)抗U18666A誘導(dǎo)的C6細胞凋亡活動的作用及其分子

3、機制。從而進一步探討PI3K/Akt信號通路在雄激素抗U18666A誘發(fā)C6細胞凋亡作用中的意義。
　　研究方法：
　　第一部分：通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術(shù)、Hochest33342染色檢測法，分別定量和定性檢測不同濃度的U18666A對C6細胞凋亡活動的形態(tài)學(xué)變化影響。
　　第二部分：通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)、Hochest33342染色檢測法從形態(tài)學(xué)上觀察DHT對

4、U18666A誘導(dǎo)C6細胞凋亡的保護作用，以及LY294002對DHT凋亡保護的阻斷作用。
　　第三部分：利用Western Blot檢測法，觀察DHT對Akt磷酸化激活作用，以及LY294002對DHT的Akt磷酸化激活作用的影響。此外，我們還進一步利用Western Blot檢測法定量觀察DHT、LY294002對凋亡相關(guān)蛋白Seladin-1、Bcl-2家族、IAP家族、Caspase-3表達變化的影響，探討PI3K/Akt

5、信號通路及其下游凋亡相關(guān)分子Seladin-1、BCL-XL、Bax、Survivin、Caspase-3表達的變化在雄激素抗U18666A凋亡作用中的分子機制。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分：免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在熒光顯微鏡微鏡下發(fā)現(xiàn)U18666A能顯著誘導(dǎo)C6細胞凋亡發(fā)生，凋亡細胞數(shù)量明顯增加。
　　通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞技術(shù)定量檢測發(fā)現(xiàn)，相較空白對照組，不同濃度(0.5μ g/ml，1.0

6、μ g/ml，2.5μ g/ml)的U18666A處理能夠顯著增加C6細胞的總凋亡率(P＜0.05)。上述結(jié)果提示，不同濃度的U18666A（實驗采用）能夠顯著誘導(dǎo)C6膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡活動。
　　第二部分：為了觀察DHT對U18666A誘導(dǎo)C6膠質(zhì)細胞亡活動的形態(tài)學(xué)影響，我們用DHT（10-2μM）預(yù)處理1h后給予U18666A(1.0μ g/ml)刺激48h，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)C6細胞凋亡細胞數(shù)量明顯減少，而PI3K抑制劑LY2

7、94002(50μ M)預(yù)處理2h后發(fā)現(xiàn)DHT的抗凋亡作用明顯被抑制。
　　此外，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，與U18666A處理組相比，DHT預(yù)處理可以明顯降低U18666A誘導(dǎo)的C6細胞總凋亡率(P＜0.05)，而PI3K抑制劑LY294002(50μ M)可以抑制DHT的抗凋亡活動(P＜0.05)。上述結(jié)果提示，DHT可以明顯阻斷U18666A誘導(dǎo)的C6細胞凋亡活動，而PI3K阻斷劑可以明顯抑制DH

8、T的抗凋亡保護作用。
　　第三部分：首先我們利用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，與U18666A處理組比較，DHT處理后C6細胞的磷酸化Akt表達量顯著升高(P＜0.05)，而LY294002預(yù)處理后能夠顯著抑制調(diào)DHT誘導(dǎo)的磷酸化Akt水平升高(P＜0.05)。上述結(jié)果提示，DHT可以明顯激活C6細胞的Akt磷酸化活動，而PI3K阻斷劑可以明顯抑制DHT的Akt激活效應(yīng)。
　　此外，我們進一步利用Western Blot

9、檢測發(fā)現(xiàn):
　　1)與空白組比較，U18666A可以明顯下調(diào)凋亡保護蛋白Seladin-1表達(P＜0.05)，上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3表達(P＜0.05);
　　2)與U18666A處理組對比發(fā)現(xiàn)，DHT預(yù)處理后可以明顯上調(diào)凋亡保護蛋白Seladin-1、Survivin、BCL-XL表達(P＜0.05)，下調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表達(P＜0.05)。
　　3)與DHT處理組(DHT+U186

10、66A)比較，PI3K阻斷劑LY294002可以明顯抑制DHT誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Caspase-3、Bax下調(diào)表達(P＜0.05)，以及抑制DHT誘導(dǎo)的Seladin-1、Survivin、BCL-XL上調(diào)表達(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論：根據(jù)上述實驗結(jié)果，在C6細胞模型上，我們發(fā)現(xiàn):
　　1)從凋亡形態(tài)學(xué)上我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的U18666A均可以明顯誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的C6細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。上述結(jié)果提示，U18666A對C6膠

11、質(zhì)細胞具有促凋亡作用。
　　2)從凋亡形態(tài)學(xué)上我們發(fā)現(xiàn)，DHT具有明顯的抗U18666A誘導(dǎo)的C6細胞凋亡效應(yīng)，而PI3K抑制劑LY294002可以明顯阻斷DHT抗凋亡保護作用，我們的結(jié)果證明，PI3K/Akt信號通路參與了DHT抗U18666A誘導(dǎo)的C6細胞凋亡效應(yīng)作用。
　　3)此外，我們發(fā)現(xiàn)DHT可以顯著上調(diào)凋亡保護蛋白Seladin-1、BCL-XL、Survivin表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達