促腎上腺皮質激素釋放因子誘導U87細胞凋亡機制的初步研究.pdf

1、背景:腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占顱內腫瘤的50％，其具有高發(fā)病率及致死率的特點。傳統(tǒng)的治療方法包括手術，放療，化療，但治療效果仍較差，尤其是針對膠質母細胞瘤，即使應用上述綜合治療，其平均生存期尚不足14.6個月。隨著人們對膠質瘤發(fā)病機制的進一步認識，神經肽類物質在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關注。促腎上腺激素釋放因子（corticotropin-releasing factor CRF）是一類最早由vale從羊下丘

2、腦中分離出的含有41個氨基酸的激素類神經肽。主要分布于人類中樞神經系統(tǒng)，以下丘腦為著，外周系統(tǒng)中分布廣泛。CRF主要作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)，調節(jié)機體在應激狀態(tài)下的內分泌，自主神經，免疫反應等方面的協(xié)調。近年來，CRF作為一類重要的神經內分泌肽，其在腫瘤方面的作用也逐漸被重視起來。CRF對其他系統(tǒng)腫瘤的作用表現(xiàn)在:CRF可以通過CRFR1的激活抑制乳腺癌細胞生長;CRF通過CRFR2的激活抑制人小細胞肺癌細胞的生長;尿皮素

3、通過CRFR2抑制肝細胞癌的腫瘤生長和血管的生成。但是，CRF對腦膠質瘤的作用及機制國內外鮮有報道。
　　目的:探索CRF對U87細胞凋亡的作用和在不同濃度的CRF作用下，對U87細胞中CRFR1，PCNA，caspase-3，cytC蛋白表達的影響及fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達的影響。
　　方法:
　　1 CCK8法檢測U87細胞凋亡
　　復蘇U87細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組置3個重復孔。3

4、7℃，5％CO2，濕化空氣培養(yǎng)24h后，更換入含有CRF的DMEM培養(yǎng)基(濃度分別為0，10-7，10-8，10-9mol/L)，設立空白對照組（不含CRF及細胞），在24h時間點加入cck-8(10ul/孔)，培養(yǎng)箱中作用3h后檢測細胞的OD值(450nm)。
　　2 Western-blot檢測CRFR1，PCNA，caspase-3，，cytC蛋白表達提取24h組細胞總蛋白，勻漿器勻漿，BCA法蛋白濃度定量，加入上樣緩沖液煮

5、沸5min，總蛋白60μg上樣到10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白質轉印至PVDF膜，轉膜條件為205mA，1.5h。5％脫脂奶粉室溫封閉2h后，TBS漂洗3次，每次5分鐘。CRFR1(1∶500)，PCNA(1∶800)，caspase-3(1∶800)，cytC(1∶800)，β-actin(1∶500)在上述一抗溶液中4℃孵育過夜。TBS洗膜5min，羊抗兔二抗溶液中常溫孵育60min?；瘜W發(fā)光儀中發(fā)光成像，并經Image

6、J對蛋白條帶進行灰度分析，計算蛋白相對值=蛋白A值/β-actin值。
　　3熒光定量PCR檢測fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達
　　Trizol法提取細胞總RNA，1.2％凝膠電泳檢測其完整性。按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，進行聚合酶鏈反應。應用DNAman軟件設計fas/fasl，Bcl-2/Bax引物序列，由北京賽百盛公司合成。置于AB7300PCR儀，95℃變性5min;95℃變性30s，55℃退火1

7、5s，72℃延伸30s，40個循環(huán);最后，產物在72℃延伸5min。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。采用2-△△CT法進行數(shù)據的相對定量分析，計算出各樣品的目的基因相對定量結果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉錄水平的差異，記錄結果數(shù)據。
　　結果:
　　1 CCK-8細胞凋亡檢測:不同濃度CRF處理的U87細胞凋亡率存在差異，有統(tǒng)計學意義(F=35.79，P＜0.05)。
　　2 Western-b

8、lot檢測:CRFR1蛋白的實驗組高于對照組，差異顯著(F=83.32，P＜0.05)。PCNA蛋白的實驗組高于對照組，差異顯著(F=36.19，P＜0.05)。cytC蛋白的實驗組高于對照組，差異顯著(F=11.93,P＜0.05)。caspase-3蛋白的實驗組高于對照組，差異顯著(F=44.82，P＜0.05)。
　　3熒光定量PCR檢測: Bcl-2 mRNA的實驗組低于對照組，差異顯著(F=138.82,P＜0.05)。

9、Bax mRNA的實驗組高于對照組，差異顯著(F=215.25，P＜0.05）。不同濃度CRF干預的U87細胞Fas mRNA的表達不全相同，有統(tǒng)計學意義(F=14.5,P＜0.05)。不同濃度CRF處理的U87細胞Fasl mRNA的表達不全相同，有統(tǒng)計學意義(F=54.14,P＜0.05)。
　　結論:
　　1 CCK8實驗顯示CRF對膠質瘤U87MG具有促進凋亡的作用。
　　2 Western-blot印跡結果顯