妊娠子宮肌中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體的臨床研究.pdf

1、計(jì)劃生育，優(yōu)生優(yōu)育是我國(guó)基本國(guó)策。如何提高人口素質(zhì)是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。而健康生殖過(guò)程是保證人口素質(zhì)的關(guān)鍵。早產(chǎn)是對(duì)母嬰安全危害較大的幾種妊娠期疾病之一。如何預(yù)防早產(chǎn)是產(chǎn)科醫(yī)師所要急迫解決的問(wèn)題。 人類妊娠是一個(gè)復(fù)雜而又需機(jī)體各部分協(xié)調(diào)的過(guò)程。胎盤作為妊娠期特殊器官，起著極其重要作用。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素是由下丘腦室旁核分泌的一種與焦慮、應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的41個(gè)氨基酸肽類激素。人們發(fā)現(xiàn)除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，CRH還分布于

2、肺、腎上腺、胃腸道等外周組織。妊娠期間的人類胎盤和胎膜組織能分泌大量的CRH，是妊娠期母體血漿CRH的主要來(lái)源。妊娠期母體血漿CRH水平及生育組織中CRH受體的研究引起人們廣泛的關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)，隨著妊娠孕婦血漿CRH水平逐漸升高，分娩時(shí)達(dá)到高峰，產(chǎn)后血漿CRH迅速下降，產(chǎn)后3～4天恢復(fù)到正常水平。McLean等研究發(fā)現(xiàn)，母體血漿CRH水平與妊娠長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為胎盤CRH猶如時(shí)鐘，決定妊娠長(zhǎng)短，是分娩的啟動(dòng)因子，血漿CRH水平

3、可以預(yù)測(cè)早產(chǎn)的發(fā)生。有人報(bào)道早產(chǎn)孕婦母體血漿CRH水平明顯升高。CRH可能通過(guò)與雌激素、腎上腺皮質(zhì)激素、前列腺素和催產(chǎn)素等的相互作用，建立分娩啟動(dòng)的正反饋環(huán)。 CRH在妊娠子宮宮底部發(fā)揮收縮作用，而在下段舒張子宮平滑肌，這可能與其受體和/或傳導(dǎo)通路不同有關(guān)。CRH受體是一種G-蛋白耦聯(lián)受體。目前已知三種CRH受體：CRHR1(1α-h)、CRHR2(2α，2β和2γ)和CRHR3。既往研究認(rèn)為妊娠子宮下段肌組織中存在CRHR1m

4、RNA，其水平比未妊娠時(shí)顯著降低；分娩時(shí)其表達(dá)顯著上調(diào)。部分妊娠婦女子宮肌組織中可檢測(cè)到CRHR2mRNA，分娩時(shí)無(wú)顯著變化。足月未分娩婦女子宮肌組織中不能檢測(cè)到免疫活性CRHR1，在分娩子宮平滑肌和子宮血管平滑肌中能檢測(cè)到免疫活性CRHR1。CRHR2蛋白在足月未分娩婦女子宮肌組織中也不能檢測(cè)到，僅在分娩子宮肌組織中能微弱地檢測(cè)到。本研究通過(guò)放射免疫測(cè)定正常妊娠孕婦母體血漿CRH水平，用Realtime-PCR方法檢測(cè)足月妊娠未分娩(

5、termnolabour，TNL)、分娩(termlabour，TL)及未妊娠(nopregnant，NP)子宮下段肌組織中CRH受體及其亞型的定量表達(dá)，用WesternBlotting檢測(cè)足月妊娠未分娩、分娩及未妊娠子宮下段肌組織中CRH受體的蛋白定量表達(dá)，并用免疫組化進(jìn)一步檢測(cè)各組子宮下段肌組織中CRH受體的蛋白分布，進(jìn)一步探討CRH及CRH受體在妊娠及分娩中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 1.放射免疫測(cè)定：(1)

6、研究對(duì)象：隨機(jī)抽選門診孕檢及住院孕產(chǎn)婦178人。根據(jù)抽取靜脈血時(shí)所在孕周的不同，將孕婦分組。(2)甲醇法提取血漿總CRH。以上海第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室神經(jīng)肽放免藥盒方法測(cè)定血漿總CRHγ記數(shù)。應(yīng)用由上海原子核儀器廠提供的專用放免r-3計(jì)算妊娠婦女血漿CRH的濃度(pg/ml)。 2.RT-PCR方法：(1)研究對(duì)象：隨機(jī)抽取足月因產(chǎn)科因素行剖宮產(chǎn)有宮縮、無(wú)宮縮孕婦及因子宮肌瘤行子宮切除患者子宮下段切口正中上緣切取適量新鮮子

7、宮肌組織標(biāo)本，排除合并惡性腫瘤者。(2)總RNA的提取及濃度測(cè)定：利用上海華舜生物公司TrizolReagent并按照制造商提供的方法提取組織中的總RNA。采用紫外分光光度法測(cè)定樣品中RNA的濃度，根據(jù)OD260/OD280的比值判斷其純度。(4)反轉(zhuǎn)錄(reversetranscription，RT)：利用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，按照制造商提供的方法，合成cDNA第一鏈。(5)Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)：利用PCR引

8、物序列CRHR1α(forward：5'-TCCgCTACAATACCAACAA-3’，reverse：5'-gCCgCAgAAAgAggACAAA-3')、CRHR2(forward：5'-AgAATgCTTggAgAATgggACg-3',reverse:5’-ACgACAAgggCgATgCggTA-3’)、GAPDH(forward：5'-gACACCCACTCCTCCACCTTTgA-3',reverse：5'-CTCTCTr

9、CCTCTrgTgCTCTrgC-3’)檢測(cè)足月妊娠有宮縮、無(wú)宮縮及未妊娠子宮下段肌組織中CRHR1α、CRHR2mRNA的定量表達(dá)。 3.Western印跡雜交方法：(1)蛋白的提?。喝∵m量組織，放入10ml的離心管內(nèi)，加含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液1ml，用勻漿機(jī)將組織粉碎，26000rpm×15sec，然后4℃離心12000rpm×1omin，留取上清，-20℃保存。(2)蛋白定量：利用Bradford方法測(cè)定所得樣本的蛋

10、白濃度。根據(jù)蛋白定量，取含有50μg蛋白的樣品加入適當(dāng)?shù)纳蠘泳彌_液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。 (3)以用新鮮抗體稀釋液配制的羊抗人CRHR1或CRHR2多克隆抗體(滴度1：400)為一抗，測(cè)定足月妊娠有宮縮、無(wú)宮縮及未妊娠子宮下段肌組織中CRHR1、CRHR2受體的定量表達(dá)。 4.免疫組化方法：以1：50倍稀釋的CRHR1(V-14)或CRHR2(C-15)(Santacruz公司)羊源性一抗，用免疫組化s—p法

11、檢測(cè)足月妊娠和未妊娠子宮下段肌組織中CRHR1、CRHR2受體蛋白的分布。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)用SPSS10.0軟件進(jìn)行處理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.正常妊娠婦女母體血漿CRH水平變化：正常孕婦血漿CRH隨妊娠逐漸升高，妊娠中期(妊娠30W為188.85±139.72pg/ml，與妊娠28W相比P＜0.05)后呈指數(shù)性升高，妊娠41周后(5

12、04.15±607.775pg/ml)及臨產(chǎn)時(shí)(503.4125±468.2563pg/m1)最高，產(chǎn)后(284.725±368.575pg/m1)迅速下降。 2.足月妊娠有宮縮、無(wú)宮縮及未妊娠子宮下段肌組織中CRH受體或其亞型mRNA的定量表達(dá)：未妊娠子宮肌組織中CRHR1αmRNA、CRHR2mRNA(0.8599±4.33，n=11；0.9802±2.42，n=6)顯著高于足月無(wú)宮縮(0.0942±0.23，n=7；0.0

13、395±0.14，n=12)、有宮縮(0.1033±0.15，n=10；0.0581±0.41，n=13)子宮(P＜0.05)。足月無(wú)宮縮、有宮縮子宮肌組織中CRHR1mRNA、CRHR2mRNA無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 3.足月妊娠有宮縮、無(wú)宮縮及未妊娠子宮下段肌組織CRH受體蛋白的定量表達(dá)：未妊娠子宮肌組織中CRHR1、CRHR2受體蛋白(1±0.7151，n=20；1±0.0365，n=17)明顯低于足月無(wú)宮縮(2.5

14、450±6.0899，n=20；3.9887±5.2081，n=17)、有宮縮(2.3775±5.0608，n=20：1.7209±4.6958，n=17)子宮(P＜0.05)。足月妊娠無(wú)宮縮、有宮縮子宮下段肌組織中CRHR1、CRHR2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 4.足月妊娠有宮縮、無(wú)宮縮及未妊娠子宮下段肌組織CRH受體蛋白的分布：CRHR1受體蛋白分布于未妊娠、足月妊娠無(wú)宮縮、有宮縮子宮下段肌組織的平滑肌及血管平滑

15、肌的細(xì)胞漿和部分細(xì)胞膜、內(nèi)膜腺體和結(jié)締組織中。 CRHR2受體在足月妊娠子宮下段平滑肌細(xì)胞漿和部分細(xì)胞膜表達(dá)，在未妊娠子宮下段肌組織中未見(jiàn)明顯表達(dá)。 結(jié)論: 1.正常孕婦母體血漿CRH水平隨妊娠逐漸升高，妊娠41周后及臨產(chǎn)時(shí)最高，產(chǎn)后迅速下降。提示妊娠期母體血漿CRH與妊娠、分娩關(guān)系密切。 2.未妊娠、足月妊娠無(wú)宮縮和足月妊娠有宮縮子宮下段肌組織中有CRHR1αmRNA、CRHR2mRNA表達(dá)；

16、3.足月妊娠無(wú)宮縮、有宮縮子宮下段肌組織中CRHR1αmRNA、CRHR2mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異。 4.未妊娠、足月妊娠無(wú)宮縮和足月妊娠有宮縮子宮下段肌組織中表達(dá)CRHR1蛋白、CRHR2蛋白； 5.足月妊娠無(wú)宮縮、有宮縮子宮下段肌組織中CRHR1蛋白、CRHR2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。 6.CRHR1受體蛋白在未妊娠、足月妊娠無(wú)宮縮、有宮縮子宮下段平滑肌細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)，平滑肌細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)；CRHR1受體