促腎上腺皮質(zhì)激素受體與腎上腺腫瘤.pdf

1、第一部分促腎上腺皮質(zhì)激素受體mRNA在腎上腺腫瘤中的表達(dá) 目的： 促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)通過其受體(ACTH-R)對腎上腺皮質(zhì)的增生、分化以及激素合成等發(fā)揮著重要的作用。隨著影像學(xué)的普及，腎上腺意外瘤的檢出率明顯增加，探討腎上腺皮質(zhì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制對診斷和治療有重要的意義。腎上腺皮質(zhì)癌中ACTH-R基因的雜合缺失增加，并伴有癌組織中ACTH-RmRNA表達(dá)降低，提示ACTH-R基因可能是抑癌基因。本研究擬檢測AC

2、TH-RmRNA在腎上腺皮質(zhì)腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤以及正常腎上腺皮、髓質(zhì)中的表達(dá)，初步探討ACTH-R與腎上腺腫瘤的關(guān)系。 方法： 用TRIZOL分別提取6例正常人腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)、2例特發(fā)性醛固酮增多癥腎上腺組織、24例腎上腺皮質(zhì)腺瘤(庫欣綜合征10例，原醛癥14例)和20例嗜鉻細(xì)胞瘤組織的總RNA；RT-PCR方法檢測不同組織中ACTH-R和內(nèi)參GAPDH mRNA的表達(dá)；計(jì)算目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值，對ACTH

3、-RmRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，比較不同組織中ACTH-R mRNA表達(dá)的差異，分析ACTH-R mRNA表達(dá)和腫瘤大小、血漿醛固酮水平等生化指標(biāo)的關(guān)系。 結(jié)果： 1．正常。腎上腺皮質(zhì)中ACTH-R/GAPDH mRNA灰度比值為0.67±士0.22；而醛固酮分泌瘤中ACTH-R/GAPDH mRNA灰度比值為1.76±0.46，明顯高于正常腎上腺皮質(zhì)(p<0.01)；皮質(zhì)醇分泌瘤中ACTH-R/GAPDHmRNA

4、灰度比值為0.27±0.09，明顯低于正常腎上腺皮質(zhì)(p=0.01)。 2．醛固酮分泌瘤中ACTHR mRNA表達(dá)(1.76±0.46)明顯高于皮質(zhì)醇分泌瘤(0.27+0.09，p<0.01)。 3．醛固酮分泌瘤中ACTH-R mRNA表達(dá)與立位刺激后血漿醛固酮水平的變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712，p=0.002)，而和腫瘤大小、臥位血漿醛固酮水平無明顯相關(guān)(p>0.05)。 4．正常腎上腺髓質(zhì)中ACTH-

5、R/GAPDH mRNA灰度比值為0.23±0.05，明顯低于正常腎上腺皮質(zhì)(p=0.006)，而嗜鉻細(xì)胞瘤組織中未見有ACTH-R mRNA的表達(dá)。 結(jié)論： 1．醛固酮分泌瘤組織中ACTH-R mRNA表達(dá)可能影響APA患者對血管緊張素Ⅱ的反應(yīng)，提示ACTH可能在部分APA的發(fā)生中起到一定作用。 2．ACTH及其受體與嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)生可能無關(guān)。 第二部分腎上腺腫瘤中促腎上腺皮質(zhì)激素受體的蛋白表達(dá)

6、 目的： 第一部分研究從mRNA水平顯示醛固酮分泌瘤中ACTH-R表達(dá)增加，但這-結(jié)果并未被所有研究證實(shí)。因此本研究擬觀察腎上腺皮質(zhì)激素受體(ACTH-R)，即褪黑素受體2(MC2-R)在腎上腺皮質(zhì)腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤以及正常腎上腺皮、髓質(zhì)中的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白水平探討ACTH受體與腎上腺腫瘤特別是醛固酮分泌瘤的關(guān)系。 方法： 分別提取6例正常人腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)、2例特發(fā)性醛固酮增多癥腎上腺組織、

7、24例腎上腺皮質(zhì)腺瘤(庫欣綜合征10例，原醛癥14例)和10例嗜鉻細(xì)胞瘤的組織總蛋白，并測定蛋白濃度。Western blot方法檢測不同組織中ACTH受體和內(nèi)參β-actin的表達(dá)；分析目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值，對ACTH受體蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，比較不同組織中ACTHR蛋白表達(dá)的差異。 結(jié)果： 1．正常腎上腺皮質(zhì)中ACTH-R/β-actin為0.80±0.37；而醛固酮分泌瘤中ACTH-R/β-act

8、in為1.09±0.09，明顯高于正常腎上腺皮質(zhì)p<0.001)。皮質(zhì)醇分泌瘤中ACTH-R/β-actin為0.47±0.09，明顯低于正常腎上腺皮質(zhì)(p=0.002)。 2．醛固酮分泌瘤中ACTH-R蛋白表達(dá)明顯高于皮質(zhì)醇分泌瘤(p<0.001)。 3．醛固酮分泌瘤中ACTH-R蛋白表達(dá)與立位刺激后血漿醛固酮的變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.733，p=0.003)，而和腫瘤大小、臥位血漿醛固酮水平未見明顯相關(guān)關(guān)系(p>

9、0.05)。 4.正常腎上腺髓質(zhì)和嗜鉻細(xì)胞瘤中未見有ACTH-R蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1．與mRNA結(jié)果一致，從蛋白水平也證實(shí)醛固酮分泌瘤組織中ACTH-R表達(dá)可能影響APA患者對血管緊張素Ⅱ的反應(yīng)，提示ACTH可能在醛固酮分泌瘤特別是血管緊張素Ⅱ無反應(yīng)的醛固酮分泌瘤的發(fā)生中起到一定作用。 2．從蛋白水平也顯示ACTH及其受體可能和腎上腺髓質(zhì)的生理和病理過程無關(guān)。 第三部分ACTH一基因

10、與腎上腺皮質(zhì)腫瘤 目的： 腎上腺皮質(zhì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，遺傳因素可能起了重要作用。ACTH-R基因啟動子區(qū)的多態(tài)性影響腎上腺皮質(zhì)雄激素和皮質(zhì)醇的合成，醛固酮分泌瘤中ACTH-R高表達(dá)、皮質(zhì)醇分泌瘤中ACTH-R低表達(dá)是否和ACTH-R基因相關(guān)尚未闡明。因此本研究擬檢測伴或不伴家族史的腎上腺皮質(zhì)腫瘤和增生患者中ACTH-R基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)中基因突變的頻率及類型，探討ACTH-R基因的遺傳學(xué)改變在腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)

11、生中的意義。 方法： 1、收集北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科2005年至2006年10月期間確診的原發(fā)性醛固酮增多癥患者78例(其中特發(fā)性醛固酮增多癥32例，醛固酮分泌瘤46例)、皮質(zhì)醇分泌瘤16例和52例年齡匹配的健康人外周血并提取基因組DNA；采集2003年至2006年10月期間在我院接受手術(shù)的APA患者組織標(biāo)本29份提取基因組DNA。 2、收集有腎上腺皮質(zhì)腺瘤家族史的2個家系和1個Addison氏病的家系部分親

12、屬的16份血標(biāo)本進(jìn)行ACTH-R基因突變檢測。 3、PCR擴(kuò)增ACTH-R基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)，對PCR產(chǎn)物直接測序以分析可能的基因突變和多態(tài)位點(diǎn)。 4、所有研究對象各SNP位點(diǎn)的Hardy-Weiberg平衡檢驗(yàn)、連鎖不平衡程度檢驗(yàn)和單倍體型分析采用SHEsis軟件進(jìn)行。 結(jié)果： 1.2例特發(fā)性醛固酮增多癥患者外周血(2/32)和4例APA患者外周血(4M6)中ACTH-R基因非編碼區(qū)不同位點(diǎn)

13、發(fā)生基因突變，其中啟動子區(qū)-41bp和-347bp位點(diǎn)的基因突變在APA中的發(fā)生率為8.7％(4/46)。 2．中ACTFH-R啟動子區(qū)和靠近編碼區(qū)3’端的非編碼區(qū)檢測到7個SNP位點(diǎn)，其中啟動子區(qū)-58bp C>T為新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，正常人群中T等位基因的頻率為8％，C等位基因頻率為92％；CC基因型頻率為85％，CT基因型頻率為15％，未檢測到TT基因型。 3．啟動子區(qū)-759bp位點(diǎn)A等位基因(rs1893

14、220)和-2bp位點(diǎn)C等位基因在皮質(zhì)醇分泌瘤患者中的頻率明顯高于醛固酮分泌瘤患者p≤0.05)。 4.對不完全連鎖的幾個SNP位點(diǎn)(rs4797824，rs1893219，和啟動子區(qū)-2bp)進(jìn)行單倍體型分析，結(jié)果顯示單倍體型分布在正常人外周血和APA瘤組織間的差異有顯著性，ATT(15％vs 1％，p<0.01)和GCT(9％vs1％，p=0.01)單倍體在醛固酮分泌瘤組織中有更高的頻率。 5.醛固酮分泌瘤患者中