促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素對(duì)腸道屏障的影響研究.pdf

1、背景：
　　腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是指伴有反復(fù)的腹痛和腸道習(xí)慣改變，沒有可解釋癥狀的器質(zhì)性病變存在的慢性功能性消化道疾病，是研究最多的功能性胃腸病（functional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GIDs）之一，其發(fā)病可能與精神應(yīng)激和腦腸軸功能紊亂有關(guān)。精神應(yīng)激可以通過破壞腦腸軸，導(dǎo)致腸道屏障的破壞和腸道通透性的增加，從而引起或者加劇腸道疾病的發(fā)生發(fā)展

2、，比如壓力可以加重IBS的癥狀。在應(yīng)激過程中，腦腸軸的一種主要激素促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing factor，CRF）的含量是增加的。腸道屏障包括粘液屏障和上皮屏障，對(duì)腸道功能的維持非常重要。杯狀細(xì)胞合成的一些分泌產(chǎn)物是腸道粘膜屏障的重要組成成分。上皮間的緊密連接蛋白是腸道上皮屏障的重要組成成分。LS174T細(xì)胞是人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，有杯狀細(xì)胞的表型和特性，能夠合成并分泌粘蛋白和與粘蛋白有關(guān)的其他

3、分泌產(chǎn)物，可以用來研究杯狀細(xì)胞的功能。LS174T細(xì)胞也是一種上皮細(xì)胞，可以用來研究腸道上皮屏障的功能。精神應(yīng)激是腸道屏障破壞的一個(gè)危險(xiǎn)因素，那么精神應(yīng)激如何通過CRF調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞的功能以及上皮間的緊密連接蛋白而影響腸道屏障的具體機(jī)制還尚不清楚，我們猜想，CRF可以通過改變腸道杯狀細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和上皮間緊密連接蛋白的表達(dá)從而破壞腸道屏障的功能。
　　目的：
　　探討促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素通過調(diào)節(jié)腸道杯狀細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和上皮

4、間緊密連接蛋白對(duì)腸道屏障的影響。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LS174T細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度(10-9，10-10，10-11，10-12mol/L)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)，PBS作為對(duì)照組;10-10mol/L的CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)或24小時(shí)，PBS作為對(duì)照組。
　　2.利用Real-Time qPCR技術(shù)觀察不同濃度的CRF對(duì)LS174T細(xì)胞分泌產(chǎn)物

5、相關(guān)基因MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3的mRNA水平表達(dá)量的影響，以確定CRF作用的最佳濃度。
　　3.利用Real-Time qPCR技術(shù)觀察10-10mol/L的CRF對(duì)LS174T細(xì)胞中MUC2，F(xiàn)UT2，TFF3，claudin-1，claudin-2，occludin和ZO-1的mRNA水平表達(dá)量的影響。
　　4.利用Western blot技術(shù)觀察10-10 mol/L的CRF對(duì)LS174T細(xì)胞中FUT2，TFF3

6、，claudin-1，claudin-2，occludin和ZO-1的蛋白水平表達(dá)量的影響。
　　5.利用免疫熒光染色和ELISA技術(shù)觀察CRF對(duì)LS174T細(xì)胞中MUC2蛋白水平表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Real-Time qPCR結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，不同濃度的CRF對(duì)LS174T細(xì)胞中MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3有不同的影響，10-10mol·L-1的CRF對(duì)腸道杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)物的影響相對(duì)明顯。

7、
　　2.Real-Time qPCR結(jié)果顯示，10-10mol·L-1的CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，MUC2(P＜0.01)，F(xiàn)UT2(P＜0.001)和TFF3(P＜0.0001)的mRNA表達(dá)量均下降;CRF作用于LS174T細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，MUC2和FUT2的mRNA表達(dá)量無明顯差異(NS)，而TFF3的mRNA表達(dá)量仍下降(P＜0.001)。
　　3.細(xì)胞免疫熒光和ELISA的結(jié)果顯示，與P

8、BS對(duì)照組相比，CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，MUC2的蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），而CRF作用于細(xì)胞24小時(shí)后，MUC2的表達(dá)無顯著性差異(NS)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，CRF作用LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，TFF3的蛋白表達(dá)量是下降的(P＜0.001)，CRF作用24小時(shí)后，F(xiàn)UT2和TFF3的蛋白水平均是下降的（P＜0.001）。
　　5.Real-Time qPCR

9、結(jié)果顯示，10-10mol/L CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，claudin-2的mRNA表達(dá)水平增加(P＜0.001)，而occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)水平在CRF作用24小時(shí)后下降(P＜0.001)。
　　6.Western blot結(jié)果顯示，CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，claudin-2的蛋白表達(dá)量增加(P＜0.001)，而CRF作用24小時(shí)后，occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)量下降（P＜0.

10、001）。
　　7.CRF作用于LS174T細(xì)胞6小時(shí)后，claudin-1的mRNA和蛋白表達(dá)量與PBS對(duì)照組相比均無顯著性差異(NS)。
　　結(jié)論：
　　1.CRF可以下調(diào)MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3的表達(dá)量，導(dǎo)致腸粘膜屏障的組成成分發(fā)生改變，對(duì)維持腸粘膜屏障功能不利。
　　2.CRF可以上調(diào)claudin-2，下調(diào)occludin和ZO-1，導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接蛋白的成分發(fā)生改變，對(duì)維持腸道上皮屏障的完整性不