促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素對腸道屏障的影響研究.pdf

1、背景：
　　腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是指伴有反復的腹痛和腸道習慣改變，沒有可解釋癥狀的器質(zhì)性病變存在的慢性功能性消化道疾病，是研究最多的功能性胃腸病（functional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GIDs）之一，其發(fā)病可能與精神應激和腦腸軸功能紊亂有關。精神應激可以通過破壞腦腸軸，導致腸道屏障的破壞和腸道通透性的增加，從而引起或者加劇腸道疾病的發(fā)生發(fā)展

2、，比如壓力可以加重IBS的癥狀。在應激過程中，腦腸軸的一種主要激素促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing factor，CRF）的含量是增加的。腸道屏障包括粘液屏障和上皮屏障，對腸道功能的維持非常重要。杯狀細胞合成的一些分泌產(chǎn)物是腸道粘膜屏障的重要組成成分。上皮間的緊密連接蛋白是腸道上皮屏障的重要組成成分。LS174T細胞是人結(jié)腸腺癌細胞，有杯狀細胞的表型和特性，能夠合成并分泌粘蛋白和與粘蛋白有關的其他

3、分泌產(chǎn)物，可以用來研究杯狀細胞的功能。LS174T細胞也是一種上皮細胞，可以用來研究腸道上皮屏障的功能。精神應激是腸道屏障破壞的一個危險因素，那么精神應激如何通過CRF調(diào)節(jié)杯狀細胞的功能以及上皮間的緊密連接蛋白而影響腸道屏障的具體機制還尚不清楚，我們猜想，CRF可以通過改變腸道杯狀細胞的分泌產(chǎn)物和上皮間緊密連接蛋白的表達從而破壞腸道屏障的功能。
　　目的：
　　探討促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素通過調(diào)節(jié)腸道杯狀細胞的分泌產(chǎn)物和上皮

4、間緊密連接蛋白對腸道屏障的影響。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人結(jié)腸腺癌細胞LS174T細胞，應用不同濃度(10-9，10-10，10-11，10-12mol/L)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)作用于LS174T細胞6小時，PBS作為對照組;10-10mol/L的CRF作用于LS174T細胞6小時或24小時，PBS作為對照組。
　　2.利用Real-Time qPCR技術觀察不同濃度的CRF對LS174T細胞分泌產(chǎn)物

5、相關基因MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3的mRNA水平表達量的影響，以確定CRF作用的最佳濃度。
　　3.利用Real-Time qPCR技術觀察10-10mol/L的CRF對LS174T細胞中MUC2，F(xiàn)UT2，TFF3，claudin-1，claudin-2，occludin和ZO-1的mRNA水平表達量的影響。
　　4.利用Western blot技術觀察10-10 mol/L的CRF對LS174T細胞中FUT2，TFF3

6、，claudin-1，claudin-2，occludin和ZO-1的蛋白水平表達量的影響。
　　5.利用免疫熒光染色和ELISA技術觀察CRF對LS174T細胞中MUC2蛋白水平表達量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Real-Time qPCR結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，不同濃度的CRF對LS174T細胞中MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3有不同的影響，10-10mol·L-1的CRF對腸道杯狀細胞分泌產(chǎn)物的影響相對明顯。

7、
　　2.Real-Time qPCR結(jié)果顯示，10-10mol·L-1的CRF作用于LS174T細胞6小時后，MUC2(P＜0.01)，F(xiàn)UT2(P＜0.001)和TFF3(P＜0.0001)的mRNA表達量均下降;CRF作用于LS174T細胞24小時后，與對照組相比，MUC2和FUT2的mRNA表達量無明顯差異(NS)，而TFF3的mRNA表達量仍下降(P＜0.001)。
　　3.細胞免疫熒光和ELISA的結(jié)果顯示，與P

8、BS對照組相比，CRF作用于LS174T細胞6小時后，MUC2的蛋白表達量降低（P＜0.05），而CRF作用于細胞24小時后，MUC2的表達無顯著性差異(NS)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，CRF作用LS174T細胞6小時后，TFF3的蛋白表達量是下降的(P＜0.001)，CRF作用24小時后，F(xiàn)UT2和TFF3的蛋白水平均是下降的（P＜0.001）。
　　5.Real-Time qPCR

9、結(jié)果顯示，10-10mol/L CRF作用于LS174T細胞6小時后，claudin-2的mRNA表達水平增加(P＜0.001)，而occludin和ZO-1的mRNA表達水平在CRF作用24小時后下降(P＜0.001)。
　　6.Western blot結(jié)果顯示，CRF作用于LS174T細胞6小時后，claudin-2的蛋白表達量增加(P＜0.001)，而CRF作用24小時后，occludin和ZO-1的蛋白表達量下降（P＜0.

10、001）。
　　7.CRF作用于LS174T細胞6小時后，claudin-1的mRNA和蛋白表達量與PBS對照組相比均無顯著性差異(NS)。
　　結(jié)論：
　　1.CRF可以下調(diào)MUC2，F(xiàn)UT2和TFF3的表達量，導致腸粘膜屏障的組成成分發(fā)生改變，對維持腸粘膜屏障功能不利。
　　2.CRF可以上調(diào)claudin-2，下調(diào)occludin和ZO-1，導致細胞間緊密連接蛋白的成分發(fā)生改變，對維持腸道上皮屏障的完整性不