促腎上腺皮質激素釋放激素-MAPKs信號途徑在銀屑病發(fā)病中的作用.pdf

1、第一部分促腎上腺皮質激素釋放激素及其受體在慢性斑塊型銀屑病皮損中表達的研究
　　 背景：
　　 銀屑病是一種常見的由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導的慢性炎癥性皮膚病，以表皮角質形成細胞過度增殖和異常分化為主要特征。本研究擬通過免疫組織化學和蛋白印跡方法觀察慢性斑塊型銀屑病患者皮損、非皮損和正常對照皮膚組織中CRH和CRH-R1的表達情況，探討皮膚中CRH和CRH-R1在銀屑病發(fā)病機制中的作用。
　　 目的：

2、
　　 用免疫組織化學和蛋白印跡法檢測慢性斑塊型銀屑病患者皮損、非皮損和正常對照皮膚組織中CRH和CRH-R1的表達情況，初步探討皮膚中CRH和CRH-R1與銀屑病的關系。
　　 方法：
　　 1.標本來源
　　 26例銀屑病患者均來自山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科門診就診或者住院病人，所有病例均經臨床確診為慢性斑塊型銀屑病。
　　 2.免疫組織化學檢測
　　 取銀屑病患者皮損、非皮損以及正常對照

3、皮膚組織進行CRH和CRH-R1免疫組織化學檢測。用Image-Pro Plus6圖像分析軟件分析圖像。抗CRH抗體，抗CRH-R1抗體。
　　 3.蛋白印跡檢測
　　 分別取銀屑病患者皮損、非皮損以及正常對照皮膚組織提取總蛋白，經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、蛋白印跡、顯影、凝膠成像系統(tǒng)成像、Quantity One成像分析軟件進行半定量分析等步驟，檢測CRH和CRH-R1的表達。抗CRH抗體，抗CRH-R1

4、抗體。
　　 結果：
　　 1.銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚CRH表達的檢測
　　 免疫組織化學染色分析：陽性表達為棕色顆粒。銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚標本均有CRH的陽性表達，主要集中在表皮層。
　　 蛋白印跡檢測結果表明：銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚均有CRH蛋白的表達。Quantity One成像分析軟件進行半定量分析：銀屑病患者皮損CRH水平較非皮損和正常對照皮膚顯著降低

5、，非皮損和正常對照皮膚中的表達差別無統(tǒng)計學意義。
　　 2.銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚CRH-R1表達的檢測結果
　　 免疫組織化學染色分析：陽性表達為棕色顆粒。銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚標本均有CRH-R1的陽性表達，主要集中在表皮層。
　　 蛋白印跡檢測結果表明：銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚均有CRH-R1蛋白的表達。Quantity One成像分析軟件進行半定量分析：銀屑病患者皮

6、損部位CRH-R1水平較非皮損部位和正常對照皮膚顯著降低，非皮損部位皮膚和正常對照皮膚CRH-R1表達差別無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1.免疫組織化學和蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損、非皮損及正常對照皮膚均有CRH和CRH-R1蛋白的表達；
　　 2.銀屑病患者皮損中存在CRH和CRH-R1的異常表達：CRH和CRH-R1在銀屑病患者皮損中的表達明顯低于非皮損及正常對照皮膚，CRH和CRH-R1的表達在非

7、皮損和正常對照組織中表達差別無統(tǒng)計學意義。
　　 第二部分促腎上腺皮質激素釋放激素及其受體/MAPKs信號傳導途徑對角質形成細胞表達VEGF和IL-18的影響
　　 背景：
　　 本研究擬在體外培養(yǎng)的HaCaT細胞中，以主要由KC細胞分泌的VEGF和IL-18為主要指標，觀察CRH對KC表達VEGF和IL-18的影響及其可能的細胞內信號傳導機制。
　　 目的：
　　 1.觀察CRH對HaCaT細胞

8、表達VEGF和IL-18的影響；
　　 2.探討MAPKs信號傳導途徑在CRH對HaCaT細胞表達VEGF和IL-18調控中的作用。
　　 方法：
　　 1.HaCaT細胞的培養(yǎng)
　　 永生化的角質形成細胞株HaCaT細胞用含10％FBS的DMEM置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
　　 2.實驗設計
　　 (1)根據(jù)參考文獻選擇100 nM CRH孵育HaCaT細胞，不同時間點收集

9、細胞，測定VEGF和IL-18 mRNA及蛋白的表達；
　　 (2)HaCaT細胞給予不同濃度CRH孵育，測定VEGF和IL-18 mRNA及蛋白的表達；
　　 (3)HaCaT細胞分別經CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259預處理1 h后，給予100 nM CRH孵育，測定HaCaT細胞VEGF和IL-18

10、mRNA及蛋白的表達；
　　 (4)HaCaT細胞給予100 nM CRH孵育，檢測ERK1/2、p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化；
　　 (5)HaCaT細胞經CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259預處理1 h后，給予CRH孵育，測定ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化改變。
　　

11、 3.實驗方法
　　 3.1.實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測VEGF和IL-18 mRNA的表達
　　 將所收集的細胞提取總RNA，經逆轉錄反應得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過real-time RT-PCR技術檢測VEGF和IL-18 mRNA的表達。
　　 3.2.雙抗體夾心ELISA法檢測VEGF和IL-18蛋白表達
　　 將所收集的細胞培養(yǎng)上清進行孵育、酶反應、顯色等步驟，酶聯(lián)

12、免疫檢測儀450nm處測量各孔吸光值，根據(jù)標準曲線計算出相應濃度。
　　 3.3.Western blot檢測ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2蛋白表達
　　 將所收集的細胞提取總蛋白，經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、蛋白印跡、顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、Quantity One成像分析軟件進行半定量分析，檢測ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1

13、.CRH對HaCaT細胞表達VEGF的影響
　　 1.1.不同時間點100 nM CRH對HaCaT細胞VEGF mRNA表達的影響
　　 100 nM CRH在一定范圍內時間依賴性降低VEGF mRNA表達，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，其中100 nM CRH孵育4 h時VEGF mRNA表達量最低。
　　 1.2.不同濃度的CRH對HaCaT細胞VEGF mRNA表達和VEGF蛋白分泌的影響
　　

14、 CRH濃度依賴性降低VEGF mRNA和蛋白表達，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 1.3.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259對CRH刺激的HaCaT細胞VEGFmRNA表達和VEGF蛋白的分泌影響
　　 1.4.MAPKs信號途徑在CRH降低HaCaT細胞表達VEGF中的作用
　　 1

15、.4.1.CRH對HaCaT細胞p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 1.4.2.CRH-R1拮抗劑antalarmin、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP600125對CRH誘導HaCaT細胞p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 2.CRH對HaCaT細胞表達IL-18的影響
　　 2.1.不同時間點100 nM CRH對HaCaT細胞IL-18 mRNA表達

16、的影響
　　 2.2.不同濃度CRH對HaCaT細胞IL-18 mRNA表達和IL-18蛋白分泌的影響
　　 2.3.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP600125對CRH刺激的HaCaT細胞IL-18mRNA表達和IL-18蛋白的分泌影響
　　 2.4.MAPKs信號途徑在CRH降低HaCaT細胞表達IL-18

17、中的作用
　　 2.4.1.CRH對HaCaT細胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 2.4.2.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580和JNK1/2阻斷劑SP600125對CRH誘導HaCaT細胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 結論：
　　 1.CRH抑制HaCaT細胞V

18、EGF和IL-18 mRNA和蛋白的表達；
　　 2.CRH能夠活化HaCaT細胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2信號途徑，CRH-R1參與了CRH對ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2信號途徑的活化；
　　 3.CRH-R1和p38 MAPK、JNK1/2信號途徑參與了CRH對HaCaT細胞VEGFmRNA和蛋白表達的抑制作用；
　　 4.CRH-R1和ERK1/2、p38 MAPK、JNK