黃連生物堿的提取及其對實驗性糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病肌病的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，嚴重影響患者生活質(zhì)量，臨床缺乏有效的治療方法。因此，研究療效可靠的中藥或有效成分具有重要的臨床應用意義?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃連及其生物堿成分(小檗堿)對于改善糖尿病及其并發(fā)癥具有明顯效果。因此，本實驗建立2型糖尿病大鼠模型，探討黃連生物堿預防給藥對糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病肌病的保護作用及其可能的機制。 方法： 1．建立高效液相色譜法測定黃連中生物堿含量的方法；

2、2．以小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿和藥根堿的總提取率作為篩選指標，通過正交實驗篩選黃連主要活性成分的最佳提取工藝； 3．采用腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素和高熱量飼料喂養(yǎng)誘導2型糖尿病大鼠模型，設立黃連生物堿低、中、高劑量組，以等劑量小檗堿原料藥為對照；觀察黃連生物堿對其體重、糖代謝、脂代謝，坐骨神經(jīng)感覺和運動傳導功能，血液流變學改變，光鏡及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的影響；并主要從糖尿病引起的代謝障礙角度，探討了黃連生物堿對糖尿病大鼠多元醇

3、代謝通路，氧自由基損傷以及神經(jīng)營養(yǎng)因子變化的影響； 4．觀察黃連生物堿對糖尿病大鼠骨骼肌糖原儲備，抗氧自由基損傷能力，復合肌肉動作電位，骨骼肌病理形態(tài)改變，運動終板形態(tài)和數(shù)量的影響。應用PCR和免疫印跡技術(shù)觀察黃連生物堿對骨骼肌胰島素信號轉(zhuǎn)導通路受體后水平的影響。 結(jié)果： 1．采用離子對高效液相色譜法，在流動相為乙腈：0.05mol·L<'-1>磷酸二氫鉀(40：60，內(nèi)含0.015mol·L<'-1>十二烷基磺

4、酸鈉)，檢測波長345nm，柱溫37℃，流速1.2ml/min的色譜條件下，可同時分離和測定黃連中5種生物堿的含量，其含量由高到低的順序為小檗堿>黃連堿>巴馬汀≥表小檗堿>藥根堿，它們之間的含量比例約為7．7：2．5：2．2：2．1：1。 2．采用8ml/g的液料比，50％乙醇回流提取4次，每次提取120min的條件提取并減壓濃縮得到黃連生物堿浸膏。浸膏中生物堿的含量分別為16.04+0.12％(15g生藥)和15.97±0.2

5、0％(150g生藥)。經(jīng)高效液相色譜法定量，黃連浸膏和黃連生物堿制品的純度分別為63.49±1.37％和95.64±2.20％。經(jīng)薄層色譜定性，黃連浸膏及黃連生物堿制品各成分的斑點位置與對照品色譜相對應。 3.黃連生物堿對糖尿病周圍神經(jīng)的保護作用 ①黃連生物堿對STZ糖尿病大鼠的體重無明顯性影響，但可降低糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白比值、降低血清總膽固醇和甘油三酯水平，提高糖尿病大鼠血清胰島素水平。 ②神

6、經(jīng)傳導：模型組的MNCV和SNCV均較空白組減慢(P<0.05)。黃連生物堿可抑制坐骨神經(jīng)傳導速度的減慢，AM組SNCV較模型組明顯提高(P<0.05)，AH組MNCV和SNCV較模型組明顯提高(P<0.05)。 ③血液流變學：黃連生物堿可降低大鼠全血粘度、血漿粘度和紅細胞聚集指數(shù)，縮短紅細胞電泳時間。AM組和AH組大鼠的全血粘度(高切200/S、中切30/S、低切3/S)、血漿粘度和紅細胞電泳時間較BM組和BH組有顯著性差異(

7、P<0.05)。AH組的紅細胞聚集指數(shù)較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 ④黃連生物堿可不同程度地減輕坐骨神經(jīng)的病理改變：降低糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)發(fā)生潰變的比例，增加有髓鞘神經(jīng)纖維密度，減少有髓神經(jīng)纖維平均截面積。AH組未見明顯的髓鞘分離，療效優(yōu)于AM組和AL組。AH組大鼠坐骨神經(jīng)發(fā)生潰變的比例明顯低于模型組(P<0.05)，AH組有髓神經(jīng)纖維截面積明顯少于模型組(P<0.05)。 ⑤氧自由基代謝： AM組、AH組血

8、漿CArr活性較模型組明顯升高(P<0.05)；AH組坐骨神經(jīng)中CAT活性較模型組升高(P<0.05)。AH組的血漿和坐骨神經(jīng)中SOD活性較模型組明顯升高(P<0.05)。AH組血漿GSH-PX活性較模型組升高(P<0.05)。AM組、AH組血漿和坐骨神經(jīng)。MDA含量較模型組降低(P<0.05)。 ⑥多元醇代謝通路：黃連生物堿預防給藥后，AM組、AH組大鼠的紅細胞醛糖還原酶活性和坐骨神經(jīng)ARmRNA的表達較模型組明顯降低(P<0

9、.05)。 ⑦坐骨神經(jīng)營養(yǎng)因子：黃連生物堿預防給藥后，AM組、AH組大鼠坐骨神經(jīng)IGF-1mRNA的表達較模型組明顯升高(P<0.05)，AH組坐骨神經(jīng)IGF-1mRNA表達較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 4.黃連生物堿對糖尿病肌病的保護作用 ①黃連生物堿中劑量和高劑量可明顯升高大鼠肌糖原水平，其中AH組大鼠肌糖原水平較模型組明顯升高(P<0.05)。 ②自由基：黃連生物堿可升高骨骼肌CAT、GS

10、H-PX活性，降低SOD活性和MDA含量，其中AM組、AH組骨骼肌CAT、GSH-PX活性升高，SOD活性和MDA含量明顯降低，較模型組有顯著性差異(P<0.05)。 ③復合肌肉動作電位：黃連生物堿預防給藥組大鼠復合肌肉動作電位的潛伏期縮短，動作電位的傳導速度加快。AM組、AH組傳導速度明顯快于模型組(P<0.05)。 ④IRS-1：黃連生物堿對IRS-1mRNA和IRS-1蛋白表達有不同程度的上調(diào)作用。AM組和AH

11、組與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05)，高劑量的上調(diào)最強。其中AH組骨骼肌IRS-1蛋白表達較BH組有顯著性差異(P<0.05)。 ⑤Akt：黃連生物堿對AktlmRNA表達有輕微的上調(diào)作用，但與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。AH組骨骼肌Akt2mRNA表達較模型組明顯升高(P<0.05)。骨骼肌中p-Akt蛋白表達增加，與模型組無顯著性差異(P>0.05)。 ⑥Glut4:黃連生物堿預防給藥組大鼠骨骼肌G

12、lut4mRNA和Glut4膜蛋白的表達增加。AM組和AH組骨骼肌Glut4mRNA和Glut4膜蛋白的表達較模型組明顯增加(P<0.05)。 ⑦p38MAPK：黃連生物堿明顯升高骨骼肌p38MAPK蛋白的表達，較模型組有顯著性差異(P<0.05)。AM組和AH組大鼠骨骼肌p38MAPK蛋白表達高于BM組和BH組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.該色譜條件可同時分離和測定黃連中5種生物堿的含量，方法靈敏、定量準確。

13、 2.采用該工藝回流提取，黃連有效成分的提取率較高，提取工藝穩(wěn)定。 3.黃連生物堿通過降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白比值和血清甘油三脂和膽固醇水平，提高糖尿病大鼠血漿胰島素水平。 4.提高坐骨神經(jīng)感覺和運動傳導速度，縮短動作電位潛伏期；調(diào)節(jié)自由基代謝紊亂，減輕脂質(zhì)過氧化反應；抑制多元醇代謝通路中AR活性和改善血液高粘狀態(tài)；增加坐骨神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達而改善糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)，提示黃連生物堿對糖尿病周