局部人工腦脊液灌洗治療大鼠重型顱腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：本課題組此前進(jìn)行了局部人工腦脊液灌洗、局灶亞低溫對腦外傷后腦水腫、細(xì)胞凋亡的影響的研究；證實(shí)了人工腦脊液灌洗對腦外傷的療效及對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。但是，人工腦脊液灌洗對正常腦組織是否存在損傷、灌洗持續(xù)時(shí)間對療效的影響、人工腦脊液灌洗調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚未闡明；而且其療效在動物臨床水平上未得到驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)通過重型顱腦損傷干預(yù)后檢測不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量、鈉鉀離子及EB含量、細(xì)胞凋亡、VEGF、P-ERK2、TNF

2、-a蛋白的表達(dá)、光鏡電鏡觀察及實(shí)驗(yàn)動物臨床神經(jīng)功能障礙評估來研究以下幾點(diǎn)：①局部人工腦脊液灌洗對正常腦組織有無損傷。②局部人工腦脊液灌洗持續(xù)時(shí)間對療效的影響。③局部人工腦脊液灌洗調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。④局部人工腦脊液灌洗對大鼠病死率、神經(jīng)功能障礙的影響。以期為人工腦脊液的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 第一部分局部人工腦脊液灌洗對大鼠正常腦組織有無損傷的實(shí)驗(yàn)研究 方法：健康成年SD大鼠77只，隨機(jī)分為正常組(N組)

3、、假手術(shù)組(SO組)、生理鹽水灌洗組(NS組)、人工腦脊液灌洗組(ACF組)，又按大鼠處死時(shí)間分為術(shù)后12小時(shí)、3天兩個(gè)亞組，每亞組6只大鼠，對照組6只，各組大鼠于各時(shí)間段處死后分別行腦組織水含量、鈉、鉀含量及電鏡的檢測。另亞組5只行伊文思藍(lán)檢測。 結(jié)果：1.腦組織含水量、離子含量及伊文思藍(lán)含量：正常腦組織人工腦脊液灌洗后12小時(shí)、3天腦組織含水量、鈉離子、鉀離子及伊文思藍(lán)含量與對照組、假手術(shù)組比較無顯著差異(P>0.05)。生

4、理鹽水灌洗后12小時(shí)、3天腦組織含水量、鈉離子及伊文思藍(lán)含量均高于對照組、假手術(shù)組，人工腦脊液灌洗組，鉀離子則相反。2.病理改變：假手術(shù)組、人工腦脊液灌洗組在各時(shí)間點(diǎn)毛細(xì)血管周圍無水腫、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞無異常；生理鹽水灌洗組可見神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)及周邊輕度水腫，核膜變??；線粒體及微血管內(nèi)皮輕度腫脹。 結(jié)論：1.人工腦脊液灌洗在保持合適的滴速下對正常腦組織無損傷。 2.生理鹽水灌洗對正常腦組織造成一定程度的損傷。

5、第二部分腦外傷后局部人工腦脊液灌洗持續(xù)時(shí)間對療效的影響 方法：健康成年SD大鼠240只，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組(SO組)、腦外傷模型組(TBI組)、人工腦脊液灌洗3小時(shí)組(FI3h組)、人工腦脊液灌洗6小時(shí)組(FI6h組)、人工腦脊液灌洗9小時(shí)組(FI9h組)；各組又按處死時(shí)間即傷后12h、1d、3d、7d分為4個(gè)亞組，每亞組6只行水含量、鈉、鉀含量與電鏡檢測；另每亞組6只行免疫組化檢測VEGF蛋白的表達(dá)， 結(jié)果：1.

6、腦組織水含量、鉀鈉離子含量及VEGF蛋白灰度值：TBI組、FI3h組、FI6h組、FI9h組傷后12小時(shí)即開始出現(xiàn)腦組織水腫，第一天達(dá)腦水腫高峰，持續(xù)至第3天，與SO組比較有顯著差異(P<0.05)；第7天降至SO組水平(P>0.05)。傷后12小時(shí)、1天、3天FI3h組、FI6h組、FI9h組含水量均低于TBI組(P<0.05)；FI6h組含水量低于FI3h組(P<0.05)；F19h組含水量低于FI6h組(P<0.05)。鈉離子含量

7、及VEGF灰度值與水含量變化趨勢一致，鉀離子含量與上述改變相反。2.病理學(xué)檢查：電鏡下發(fā)現(xiàn)TBI組神經(jīng)細(xì)胞水腫明顯，線粒體腫脹、血腦屏障破壞，F(xiàn)I3h組、FI6h組、FI9h組均有不同程度的減輕。 結(jié)論：1.局部人工腦脊液灌洗能夠抑制VEGF蛋白表達(dá)。 2.延長局部人工腦脊液灌洗時(shí)間能夠減輕腦水腫。 第三部分局部人工腦脊液灌洗通過ERK通路對重型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 方法：健康成年SD大鼠192只

8、，隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組(SO組)、腦外傷模型組(TBI組)、局部人工腦脊液灌洗組(ACF組)、局部生理鹽水灌洗組(NS組)；各組又按處死時(shí)間即傷術(shù)后6h、12h、1d、3d分為4個(gè)亞組，每亞組6只行蛋白免疫印記(western blot)檢測；另每亞組6只檢測細(xì)胞凋亡及免疫組化。 結(jié)果：1.P-ERK2蛋白表達(dá)：TBI組、ACF組、NS組傷后6小時(shí)表達(dá)增加，12小時(shí)到達(dá)高峰，第1天下降，第3天仍高于SO組(P<0.05)。在

9、各時(shí)間點(diǎn)P-ERK2蛋白表達(dá)的關(guān)系為ACF組

10、3天仍明顯高于SO組(P<0.05)。在各時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的關(guān)系為ACF組

11、TBI組)、局部人工腦脊液灌洗組(ACF組)，每組12只，分別于術(shù)后1d、3d、7d、14d、28d檢查每組大鼠的神經(jīng)功能障礙評分(Modified neurological Severity Scores；mNSS評分)：于傷后1d、3d、7d、14d、28d利用平衡木行走實(shí)驗(yàn)(Beam walking testBWT)來評估大鼠的精細(xì)運(yùn)動和協(xié)調(diào)能力；爬坡實(shí)驗(yàn)(angling test)用于檢測大鼠的四肢肌力變化。并于傷后7d統(tǒng)計(jì)TB

12、I組、ACF組大鼠的死亡率。 結(jié)果：1.mNSS評分：TBI組傷后神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重(mNSS評分高)，以后逐步恢復(fù)，14天后神經(jīng)功能基本恢復(fù)正常；ACF組在傷后3d、7d mNSS評分較TBI組低(P<0.05)，1d、14d、28d無明顯差異(P>0.05)。2.BWT時(shí)間：TBI組、ACF組傷后1d、3d、7d、14d行走時(shí)間延長，與術(shù)前、SO組比較有顯著差異(P<0.05)，28天后與術(shù)前、SO組比較無明顯差異(P>0.0

13、5)。其中ACF組在3d、7d、14d行走時(shí)間延長少于TBI組(P<0.05)；而在傷后1d、28d比較無顯著差異(P>0.05)。3.爬坡實(shí)驗(yàn)：TBI組、ACF組傷后1d、3d、7d、14d爬坡角度變小，與術(shù)前、SO組比較有顯著差異(P<0.05)，傷后1d、28天與術(shù)前、SO組比較無明顯差異(P>0.05)。其中ACF組在3d、7d、14d爬坡角度大于TBI組(P<0.05)，而在傷后1d、28d比較無顯著差異(P>0.05)。4.