診治法布萊氏病的單抗及重組蛋白的研制.pdf

1、法布萊氏病是一種X連鎖隱性遺傳病，由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A(alpha-galactosidaseA，α-GalA)基因突變使酶失活造成。研究表明，人體內(nèi)α一半乳糖苷酶的先天性缺乏而致使其底物N-脂酰鞘氨醇己三糖苷在全身細(xì)胞、組織和器官中累積而引起血液循環(huán)障礙并進(jìn)一步導(dǎo)致心、腎功能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂而死亡。法布萊氏病在男性中發(fā)病率為1/40000，而且在早期一般很難診斷。若不能及時(shí)診斷治療，患者一般在40歲左右就會(huì)死于心、腎功

2、能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，女性發(fā)病時(shí)間稍晚，一般在40-50歲發(fā)病。法布萊氏病的早期診斷治療對(duì)阻止病情發(fā)展，改善病人生存質(zhì)量，延長(zhǎng)病人生存時(shí)間具有重要意義。 利用α-半乳糖苷酶A單抗檢測(cè)患者體內(nèi)的α半乳糖苷酶A蛋白水平是法布萊氏病早期診斷的可靠方法。為了獲得效價(jià)高的、特異性強(qiáng)的抗人α-半乳糖苷酶A單克隆抗體，本文使用計(jì)算機(jī)軟件分析α-半乳糖苷酶A的優(yōu)勢(shì)抗原表位，合成2個(gè)具有強(qiáng)抗原性的多肽并與載體蛋白KLH偶聯(lián)，免疫小鼠，采用甲基纖維

3、素半固體培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞株。使用酶聯(lián)免疫、SDS-PAGE、Western-Blot和染色體核型分析等方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單抗進(jìn)行鑒定。篩選到1株穩(wěn)定表達(dá)α半乳糖苷酶A單抗雜交瘤細(xì)胞株。制備的單抗屬I(mǎi)gG1亞型，能夠特異性地與人α-半乳糖苷酶A反應(yīng)，并展示出很強(qiáng)的親和力。采用酶聯(lián)免疫方法用獲得的單克隆抗體檢測(cè)12例正常人及5例法布萊氏病患者血漿中的α-半乳糖苷酶A。結(jié)果患者組的OD<,450>吸光度平均值為0.159±0.06

4、3(最大0.238，最小0.080)，低于正常組的平均吸光度值0.481±0.116(最大0.694，最小0.332)。同時(shí)酶活性檢測(cè)血漿中α-半乳糖苷酶活性，患者組的吸光度平均值為0.015±0.008(最大0.024，最小0.004)，低于正常組的吸光度平均值0.032±0.006(最大0.044，最小0.022)。但是在抗體檢測(cè)的結(jié)果中一例患者的OD<,450>吸光度值接近正常人的，這是因?yàn)橛械牟∪甩涟肴樘擒彰窤蛋白有較高的表達(dá)水

5、平，卻無(wú)水解活性。將單抗檢測(cè)與酶活性檢測(cè)相結(jié)合，可以增加了斷的可靠性，為進(jìn)一步研究法布萊氏病的診斷奠定了基礎(chǔ)。 向病人體內(nèi)注射α-半乳糖苷酶A的酶替代療法是目前治療法布萊氏病最有效的方法，但如何獲得足量、高純度的α-半乳糖苷酶A是使用酶替代療法的前提。本文的另一個(gè)目的是克隆人α-半乳糖苷酶A(α-GalA)cDNA，并在畢赤酵母中表達(dá)重組的人α-GalA。利用RT-PCR方法從人肝癌細(xì)胞中克隆人伐．半乳糖苷酶A cDNA，測(cè)序結(jié)

6、果說(shuō)明獲得的序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致。將α-半乳糖苷酶A cDNA構(gòu)建到可用甲醇誘導(dǎo)的分泌型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA。重組載體導(dǎo)入畢赤酵母后使用Zeion抗生素篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在甲醇誘導(dǎo)后，使用SDS-PAGE、Western印跡及酶活測(cè)定方法檢測(cè)酵母上清中人α-GalA。我SDS-PAGE結(jié)果表明在酵母培養(yǎng)上清中有大約46KD的條帶，與預(yù)期的α-GalA的大小一致，該條帶能夠特異的與抗α-GalA單抗結(jié)合。進(jìn)一步研究表明培養(yǎng)上清中有α-