基于診斷治療學(xué)多功能納米系統(tǒng)用于肝細(xì)胞癌的分子診斷與治療.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，化學(xué)治療是臨床上主要的治療手段之一。目前，化療常常遇到以下兩個(gè)難題:
　?、僦委煼绞椒莻€(gè)體化，所有病人基于群體通用劑量給藥，會(huì)因病人個(gè)體差異等因素產(chǎn)生超敏或無(wú)效現(xiàn)象，導(dǎo)致用藥失敗;
　?、诏熜гu(píng)估往往在一個(gè)治療周期之后，具有時(shí)間滯后性，從而錯(cuò)過(guò)了使治療最佳時(shí)機(jī)。
　　診斷治療學(xué)（Theranostics）是一種將分子診

2、斷與分子治療相結(jié)合的治療策略，近年來(lái)作為一種新型疾病治療策略，特別是在腫瘤治療方面受到了人們廣泛的關(guān)注?；谠\斷治療學(xué)的治療模式能夠?qū)崿F(xiàn)：
　?、倏梢暬幬矬w內(nèi)遞送過(guò)程;
　?、诳梢暬幬镌诮o藥靶部位的分布和釋放過(guò)程;
　　③在治療的同時(shí)進(jìn)行診斷，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的實(shí)時(shí)監(jiān)控和個(gè)體化給藥等。
　　因此，診斷治療學(xué)對(duì)HCC治療過(guò)程中治療效果的實(shí)時(shí)監(jiān)控、及時(shí)調(diào)整給藥劑量或治療方案、實(shí)現(xiàn)病人個(gè)體化給藥并提高腫瘤治療效果具有重

3、要意義。
　　本課題基于Theranostics理論，設(shè)計(jì)和制備一種多功能納米載體用于HCC的個(gè)體化給藥，以提高治療效果，降低毒副作用。首先，選擇聚合物納米粒作為Theranostics載體，設(shè)計(jì)合成具有載藥、長(zhǎng)循環(huán)和方便后期修飾的多功能材料聚乳酸-聚乙二醇-聚賴氨酸(poly(lactic acid)-Poly(ethylene glycol)-Polylysine，PLA-PEG-PLL)，具有pH敏感性和長(zhǎng)循環(huán)性的多功能材料

4、聚組氨酸-聚乙二醇-生物素(Polyhistidine-Poly(ethylene glycol)-Biotin，PLH-PEG-Biotin）;然后，選取紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和索拉菲尼為治療HCC的模型藥物，基于釓(Gd)的磁共振顯影（Magnetic Resonance Imaging，MRI）模式為診斷手段，分別以腫瘤微環(huán)境高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth fact

5、or,VEGF）、甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)為靶點(diǎn)，自組裝手段制備了三種多功能聚合物納米載體，分別為:
　?、侔邢蛑委煂W(xué)多功能納米粒（靶向VEGF載PTX聚合物納米粒，Target PTX-loaded nanoparticles，TPN）；
　　②診斷治療學(xué)多功能納米粒(靶

6、向AFP載Gd/PTX聚合物納米粒，Target Gd/PTX-loaded nanoparticles，TGPN)；
　?、踦H敏感診斷治療學(xué)多功能納米粒(pH敏感靶向VEGFR載Gd/PTX聚合物納米粒，Target pH-sensitive theranostic nanoparticles，TPTN);
　　最后，分別對(duì)三種多功能納米載體的理化性質(zhì)、體外釋放行為、細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取、體外MRI性質(zhì)、體內(nèi)MRI性質(zhì)、體

7、內(nèi)抑瘤性質(zhì)和組織安全性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期提高HCC的分子靶向治療和治療監(jiān)控效果，實(shí)現(xiàn)HCC病人個(gè)體化治療。
　　課題主要研究方法與結(jié)果如下:
　　1.多功能材料的合成與表征
　　為構(gòu)建多功能診斷治療學(xué)聚合物納米載體，課題首創(chuàng)聚合物綴合技術(shù)，合成兩種新型多功能高分子材料PLA-PEG-PLL和PLH-PEG-Biotin。聚合物綴合技術(shù)是指利用化學(xué)反應(yīng)，將具不同功能的單嵌段材料化學(xué)連接得到多嵌段多功能聚合物的技術(shù)。與傳統(tǒng)聚

8、合反應(yīng)方法比較，該方法合成過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)需嚴(yán)苛的反應(yīng)條件，產(chǎn)物純化簡(jiǎn)單，并能夠相對(duì)準(zhǔn)確地控制每一嵌段的分子量。此外，利用聚合物綴合技術(shù)可以將任意具有活性基團(tuán)的嵌段相連接，具有多嵌段材料制備的可創(chuàng)造性。
　　1.1、PLA-PEG-PLL的合成與表征
　　利用酰胺反應(yīng)，將PLA-COOH分別連接NH2-PEG-NH2得到PLA-PEG-NH2，然后連接PLL(Cbz)-COOH得到PLA-PEG-PLL(Cbz)，最后氨基脫保護(hù)

9、得到結(jié)合載藥、長(zhǎng)循環(huán)和易于修飾多功能于一體的多功能材料PLA-PEG-PLL。通過(guò)核磁驗(yàn)證了每一步合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過(guò)凝膠色譜得到PLA，PLA-PEG和PLA-PEG-PLL的數(shù)均分子量和多分散系數(shù)分別為13691(1.427)、16013(1.277)和20441(1.358)。利用芘熒光探針?lè)y(cè)得PLA-PEG-PLL的臨界膠束濃度值為7.70×10-3mg/mL(3.76×10-7Mol/L)。基于PLA-PEG-PLL，利用酰

10、胺反應(yīng)，合成了PLA-PEG-PLL-DTPA和PLA-PEG-PLL-Biotin，分別用于Gd裝載和靶向抗體修飾。
　　1.2、PLH-PEG-Biotin
　　利用酰胺反應(yīng)，將Biotin-PEG-NH2與PLH-COOH反應(yīng)得到PLH-PEG-Biotin，通過(guò)核磁驗(yàn)證了合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。通過(guò)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)證明PLH-PEG-Biotin pKb值在pH5～7之間，處于血液pH與腫瘤微環(huán)境pH之間，具有在腫瘤組織實(shí)現(xiàn)納米

11、粒pH敏感性釋藥的能力。
　　2.靶向治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　靶向治療能夠提高HCC的治療效果，降低化療藥物對(duì)正常組織的毒性，是目前研究的熱點(diǎn)之一。因此，本文首先制備TPN用于HCC的靶向治療。首先建立PTX高效液相色譜檢測(cè)方法，PTX在選定液相條件下峰型良好，符合方法學(xué)考察要求。利用自組裝方法制得TPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為203.6±4.10nm，Zeta電位為20.76±0.34mv，包封率和載藥

12、量分別為86.23±1.79％和1.42±0.03％。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，與Taxol(@)比較，TPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Higuchi方程Q=8.0449t1/2-0.5721，R=0.9678。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPN的細(xì)胞毒性（IC50=0.392±0.012μM）顯著高于Taxol(@)（IC50=3.554±0.233μM）和PN（IC50=1.510±0.099μM）(P＜0.01)，具有良好的體外抗腫瘤活性。在

13、細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPN的攝取具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記PN(P＜0.01)。在體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中，與NS、Taxol(@)、PN比較，TPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(zhǎng)(P＜0.01)，TPN組生存時(shí)間（大于30d）長(zhǎng)于Taxol(@)組(23d)和PN(27d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPN能夠?qū)崿F(xiàn)HCC的靶向治療，提高治療效果，具有重

14、要的應(yīng)用前景。
　　3.診斷治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　為實(shí)現(xiàn)HCC的Theranostics，需要在腫瘤靶向治療的基礎(chǔ)上添加實(shí)時(shí)診斷模式。課題基于功能集成組裝的思路，將Gd的MRI顯影模式添加至TPN中，制備TGPN用于HCC的Theranostics研究。利用自組裝方法制得TGPN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為147.50±4.71nm，Zeta電位為24.45±1.04mv，包封率和載藥量分別為88.76±1

15、.64％和1.59±0.06％。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，與Taxol(@)比較，TGPN表現(xiàn)出緩釋特性，釋放曲線符合Weibull方程lnln[1/(1-Q/100)]=0.696lnt-6.5891(R=0.9533)。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，TGPN在24h的細(xì)胞毒性高于Taxol(@)和GPN(P＜0.05)，具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標(biāo)記TGPN的細(xì)胞攝取具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，在AFP陽(yáng)性HepG2細(xì)胞中，孵育0.5h后，F(xiàn)I

16、TC標(biāo)記TGPN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記GPN(P＜0.01)，在AFP陰性B16細(xì)胞中，F(xiàn)ITC標(biāo)記TGPN與FITC標(biāo)記GPN的攝取率之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，證明AFP抗體能夠促進(jìn)TGPN在HepG2細(xì)胞中的攝取。體外MRI評(píng)價(jià)表明TGPN具有高弛豫率(25.388mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的5.18倍。在體內(nèi)MRI實(shí)驗(yàn)中，給藥TGPN后，小鼠腫瘤區(qū)域的顯影信號(hào)增強(qiáng)AUC值為馬根維顯(

17、@)的87.6倍，信號(hào)峰值為馬根維顯(@)的2.94倍，并能顯著延長(zhǎng)診斷時(shí)間，從馬根維顯(@)的小于1h延長(zhǎng)至6h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。與NS、Taxol(@)、比較，TGPN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤體積的增長(zhǎng)(P＜0.01)，TPN組生存時(shí)間(20d)長(zhǎng)于Taxol(@)組(11d)和PN(15d)，具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TGPN具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力，能夠?qū)崿F(xiàn)治療過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而利于實(shí)現(xiàn)

18、給藥個(gè)體化，具有重要的應(yīng)用潛力。
　　4.pH敏感診斷治療學(xué)多功能納米粒的制備與表征
　　腫瘤組織的定位釋藥策略能夠提高診斷治療學(xué)納米載體治療效果和診斷靈敏度，更有利于發(fā)揮Theranostics策略優(yōu)勢(shì)。因此，本文設(shè)計(jì)具有pH響應(yīng)性釋藥能力的Theranostics納米粒，制備TPTN用于HCC的診斷治療研究。首先建立索拉菲尼高效液相色譜檢測(cè)方法，索拉菲尼在選定的液相條件下峰型良好，符合方法學(xué)考察要求。利用自組裝方法制得T

19、PTN外觀圓整，呈球形或類球形，粒徑為181.4±3.4nm，Zeta電位為14.95±0.60mv，包封率和載藥量分別為95.02±1.47％和2.38±0.04％。在含10％血清條件下，TPTN在2～4h內(nèi)粒徑保持穩(wěn)定，證明穩(wěn)定性良好。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，TPTN的釋放具有pH依賴性，其在pH=5.0的釋放介質(zhì)中釋放速率顯著高于pH=7.4的釋放介質(zhì)(P＜0.01)。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，TPTN在pH=5.0環(huán)境中孵育1h后的細(xì)胞毒性與

20、索拉菲尼溶液相當(dāng)，證明TPTN具有良好的體外抗腫瘤活性。FITC標(biāo)記TPTN的細(xì)胞攝取具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，在不同濃度下，F(xiàn)ITC標(biāo)記TPTN的攝取率顯著高于FITC標(biāo)記PTN(P＜0.01)。體外MRI評(píng)價(jià)表明TPTN具有高弛豫率(17.300mM-1s-1)，是馬根維顯(@)(4.9mM-1s-1)的3.53倍。腫瘤模型小鼠靜脈給藥TPTN后，小鼠腫瘤區(qū)域與周圍組織之間的信號(hào)對(duì)比明顯，肉眼可以觀察到明顯的腫瘤邊界，并能顯著延長(zhǎng)

21、診斷時(shí)間，從馬根維顯(@)的小于1h延長(zhǎng)至1.5h以上，具有良好的體內(nèi)MRI診斷能力。在體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中，與NS、索拉菲尼溶液（口服或靜注）、PTN比較，TPTN能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(P＜0.01)，說(shuō)明TPTN具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過(guò)組織免疫切片觀察，小鼠靜脈注射TBN后，各個(gè)臟器與注射生理鹽水組相應(yīng)臟器比較沒(méi)有明顯的組織毒性，證明TBN是一個(gè)相對(duì)安全的載體。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TPTN在具有優(yōu)秀的HCC診斷和治療能力的同