促性腺激素對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞體外發(fā)育及大鼠肝S9孵育體系中膽固醇代謝的影響研究.pdf

1、促性腺激素是人類輔助生殖技術(shù)(ART)控制性促排卵中常用的藥物。在美國(guó)，依賴該藥物誕生的試管嬰兒占出生嬰兒的1％以上。目前，臨床上常使用的促性腺激素藥物包括Gonal-F，F(xiàn)ollism，Bravelle，Luveris，Menopur，Repronex，Norvael等。促性腺激素在促進(jìn)多個(gè)竇卵泡發(fā)育至優(yōu)勢(shì)卵泡以及激素藥物替代中起到至關(guān)重要的作用。
　　卵泡刺激素(FSH)是復(fù)雜的異質(zhì)二聚體糖蛋白，由二個(gè)非共價(jià)鍵及α和β蛋白亞單

2、位構(gòu)成。FSH相對(duì)分子質(zhì)量約30000 Da。卵泡刺激素是卵泡成熟及產(chǎn)生類固醇激素必需的激素。同時(shí)，F(xiàn)SH能促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，刺激顆粒細(xì)胞上細(xì)胞色素P450家族中芳香化酶的表達(dá);FSH能夠產(chǎn)生減數(shù)分裂活性物質(zhì)，啟動(dòng)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。減數(shù)分裂的恢復(fù)以卵母細(xì)胞核膜的破裂為標(biāo)志。大量的研究表明，卵泡液中高FSH水平將導(dǎo)致受精失敗、胚胎發(fā)育異常及種植失敗。但小劑量促性腺激素不足以刺激卵巢產(chǎn)生足夠多卵子用于常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF)或卵胞漿

3、內(nèi)單精子注射(ICSI)。促性腺激素應(yīng)用的劑量及聯(lián)合用藥方案是否影響卵母細(xì)胞成熟及其發(fā)育，其機(jī)制尚不清楚。
　　體外研究表明，F(xiàn)SH誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞上某信號(hào)的合成，克服了次黃嘌呤對(duì)減數(shù)分裂的阻滯。研究發(fā)現(xiàn)促減數(shù)分裂甾醇(MAS)可誘導(dǎo)體外卵母細(xì)胞甚至裸卵成熟。MAS是膽固醇生物合成中羊毛甾醇合成膽固醇的中間產(chǎn)物。MAS家族中最具特點(diǎn)的是從人卵泡液中提取的FF-MAS和牛睪丸組織的T-MAS。FSH是否通過MAS作為信號(hào)傳導(dǎo)分子誘導(dǎo)卵母

4、細(xì)胞成熟或者通過MAS誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù)，目前仍然不清楚。
　　研究目的：
　　1.研究不同濃度Gonal-F; Follism; Bravelle; Luveris; Menopur;Repronex;Norvarel和配對(duì)組合促性腺激素Bravelle+Menopur; Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel行牛未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，評(píng)估卵母細(xì)胞成熟程度，為優(yōu)化臨床促排卵方案以及提高

5、IVF成功率提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　2.研究六組配對(duì)促性腺激素Follism+Repronex; Follism+Menopur;Bravelle+Repronex; Bravelle+Menopur; Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞行體外成熟培養(yǎng)并授精，評(píng)估卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育情況，篩選出最優(yōu)的配對(duì)促性腺激素，為臨床ART促排卵方案的選擇提供理論依據(jù)。
　　3.探討三種

6、不同濃度促性腺激素Gonal-F; Follism和Fostimon對(duì)大鼠肝S9孵育體系中膽固醇含量的影響，為進(jìn)一步研究促性腺激素作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1、標(biāo)本來源
　　購(gòu)買美國(guó)Minitube公司5202枚牛未成熟卵母細(xì)胞，卵泡直徑約4-6 mm(GV，MI階段);購(gòu)買河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康成年雄性SD大鼠(體重200±20g)20只。
　　2、實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1 IVM培養(yǎng)

7、　　3921枚牛未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)于不同分組不同濃度的促性腺激素與含10％胎牛血清的TCM-199培養(yǎng)基中，置于39℃，5％CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行成熟培養(yǎng)。
　　實(shí)驗(yàn)分為十組，分別為Gonal-F，F(xiàn)ollism，Bravelle，Luveris，Menopur，Repronex, Norvarel; Bravelle+Menopur; Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel。每種藥物濃度分別為0，5，1

8、0，20，40IU/mL（Norvarel的單位是USP/mL）;培養(yǎng)24h、48h后，解剖顯微鏡下評(píng)估COCs擴(kuò)展程度，倒置顯微鏡下評(píng)估卵母細(xì)胞核成熟(GⅤ，MⅠ，MⅡ)及第一極體排出情況。
　　2.2牛精子授精及胚胎培養(yǎng)
　　1281枚牛未成熟卵母細(xì)胞加入不同分組的促性腺激素與含10％胎牛血清的TCM-199培養(yǎng)基中行成熟培養(yǎng)，24h后進(jìn)行牛精子授精。受精后放于10％胎牛血清TCM-199培養(yǎng)基中，置39℃，5％CO2培

9、養(yǎng)箱中進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。
　　實(shí)驗(yàn)分為六組，分別為Follism+Repronex; Follism+Menopur; Bravelle+Repronex; Bravelle+Menopur; Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur，未添加藥物組設(shè)為空白對(duì)照組。每種藥物濃度為40IU/mL。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)24h后與牛精子進(jìn)行授精，授精后24、48、72、96h觀察胚胎發(fā)育情況并評(píng)估，培育7-8天評(píng)估桑椹胚-

10、囊胚發(fā)育情況。
　　2.3大鼠肝S9孵育體系添加不同F(xiàn)SH后檢測(cè)膽固醇含量
　　購(gòu)買20只雄性成年大鼠，制備大鼠肝S9孵育體系。將三種FSH藥物Gonal-F; Follism和Fostimon配制成高中低三個(gè)濃度，加入其中，孵育不同時(shí)間，用LC-MSMS方法測(cè)定大鼠肝S9中的膽固醇濃度。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較采用多因素

11、方差分析和卡方檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1、體外卵母細(xì)胞成熟情況
　　無(wú)論單種還是配對(duì)促性腺激素行體外卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)均劑量依賴性顯著性促進(jìn)COCs的擴(kuò)展。Bravelle，Luveris，Menopur和Repronex培養(yǎng)24h后顯著性擴(kuò)展COCs;然而，Norvarel依劑量依賴的方式促進(jìn)卵母細(xì)胞COCs的擴(kuò)展(10到40 IU/mL; P＜0.05)。20或40 I

12、U/mL Bravelle(B), Luveris(L), Menopur(M),Repronex(R)，Gonal-F(G)，F(xiàn)ollism(F)以及20或40 USP/mL Norvarel(N)培養(yǎng)24h和48h卵母細(xì)胞成熟率分別是20 IU/mL B為13.1％和45.0％;40 IU/mL B為25.0％和57.1％;20 IU/mL的L為33.3％和37.5％;40 IU/mL的L為33.3％和53.6％;20 IU/mL

13、M為50.0％和71.4％;40 IU/mL M為56.3％和76.2％;20 IU/mL R為53.8％和81.3％;40 IU/mL R為55.0％和81.8％;20IU/mL G為15.1％和16.2％;40 IU/mL G為38.9％和39.5％;20 IU/mL F為22.2％和39.2％;40 IU/mL F為37.3％和40.6％;20 USP/mL N為37.5％和44.4％以及40 USP/mL N為40.0％和71.

14、4％。配對(duì)藥物組在10或40 IU/mL的M+B，R+B和B+N體外卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)24和48h，卵母細(xì)胞成熟率分別是M+B(10 IU/mL)為37.9％和66.7％; M+B(40 IU/mL)為80.0％和73.9％; R+B(10IU/mL)為50.0％和73.9％; R+B(40 IU/mL)為81.8％和78.9％; B+N(10 IU/mL)為52.4％和75.0％以及B+N(40 IU/mL)為56.2％和62.5％。實(shí)

15、驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度促性腺激素在單種（如N和F）或配對(duì)組（如B+N）體外成熟培養(yǎng)48h將導(dǎo)致成熟障礙，所以，促性腺激素濃度在40 IU/mL時(shí)行體外成熟培養(yǎng)最合適的時(shí)間是24h。
　　2、IVF和早期胚胎發(fā)育
　　配對(duì)促性腺激素(40 IU/mL)培養(yǎng)24h后，R+F，M+F，R+B，M+B，R+G，M+G與空白對(duì)照組比較，卵母細(xì)胞成熟率分別是88.4％，93.4％，80.7％，80.9％，82.0％，81.7％和14.19％(

16、P＜0.05)，受精率分別是67.8％，68.2％，71.5％，68.7％，72.1％，63.1％和33.9％(P＜0.05).8-16細(xì)胞胚胎率分別是33.3％，34.1％，40.0％，50.0％，41.5％和31.3％(P＞0.05);桑椹胚-囊胚率分別是21.2％，20.5％，26.0％，30.0％，26.8％和25.0％(P＞0.05)。
　　3、LC-MSMS方法測(cè)定膽固醇的線性范圍，62.5-1000ng/ml。回收率

17、高，97.5-102.4％;精密度好，RSD＜3％。
　　4、Follism，Gonal-F促進(jìn)大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的合成，F(xiàn)ostimon促進(jìn)大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的代謝。
　　Follism在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度在0-20min區(qū)間是增加的，且有濃度依賴關(guān)系;隨著孵育時(shí)間及濃度的增加，在20min-40min之間，則成下降趨勢(shì);隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度的Follism組在40min后，其膽固醇的濃

18、度隨之增大，而中、高劑量則在40min-80min升高，80min后開始下降。低劑量的Gonal-F組與對(duì)照組比較，在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度在0-100min區(qū)間，逐步增加到孵育40min后為峰值，然后逐漸下降，與空白組接近。而高、中劑量組變化趨勢(shì)與低劑量相似，但是變化區(qū)間小與低劑量。
　　低劑量的Fostimon組在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度與對(duì)照組比較，在0-100min區(qū)間是先減少的，到孵育20min后為谷值

19、，然后逐漸升高，與空白組接近，且有劑量依賴關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.七種促性腺激素藥物(Gonal-F; Follism; Bravelle; Luveris; Menopur;Repronex; Norvarel)在體外培養(yǎng)未成熟卵母細(xì)胞可顯著性增加COCs擴(kuò)展及卵母細(xì)胞成熟，其中，Menopur和Repronex作用最強(qiáng)，配對(duì)組則以Menopur+Follism為著。
　　2.促性腺激素包括FSH、LH及hCG三

20、類分別與體外牛未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)48h均促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。
　　3.六組配對(duì)促性腺激素(Follism+Repronex; Follism+Menopur; Bravelle+Repronex; Bravelle+Menopur; Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur)影響胚胎2細(xì)胞前的卵母細(xì)胞發(fā)育及早期胚胎的形成;對(duì)未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的囊胚，在形態(tài)學(xué)上比較沒有顯著性差異。
　　4.LC-