毛竹細(xì)胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3研究.pdf

1、竹林是我國(guó)重要的森林資源，竹材是由各種類型細(xì)胞的細(xì)胞壁及其包圍的空間所組成的復(fù)雜生物材料，因其具有強(qiáng)度高、韌性好、硬度大等特點(diǎn)而在建筑、造紙等領(lǐng)域得到廣泛的利用。竹子優(yōu)良的材性特點(diǎn)與其細(xì)胞壁的組成及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，竹子細(xì)胞壁的發(fā)育對(duì)竹子的生長(zhǎng)發(fā)育、生理特性、生化代謝以及對(duì)外界環(huán)境脅迫的有機(jī)反應(yīng)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)竹子材性的形成起著決定性作用。細(xì)胞骨架指導(dǎo)細(xì)胞壁的生物合成，作為細(xì)胞骨架的重要組成部分，微管蛋白在細(xì)胞壁發(fā)育過程中起著重要的

2、調(diào)控作用。本研究以我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)竹種--毛竹（Phyllostachys edulis）為材料，分離細(xì)胞骨架微管蛋白基因，在對(duì)其序列進(jìn)行充分分析的基礎(chǔ)上，通過體外表達(dá)和在模式植物中的表達(dá)來驗(yàn)證其功能，以其為通過基因工程手段培育竹類植物新品種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、采用RT-PCR方法從毛竹葉片中克隆了2個(gè)微管蛋白基因，分別命名為PeTua3和PeTub3。PeTua3的編碼區(qū)為1353 bp，編碼451個(gè)氨基酸；PeT

3、ub3的編碼區(qū)1341 bp，編碼447個(gè)氨基酸。
　　2、Blast分析表明PeTua3和PeTub3與已報(bào)道的其它植物的tubulin蛋白具有很高的相似性，分別屬于 tubulin蛋白的Tua3和 Tub3家族，都是疏水性酸性蛋白。通過MOTIFSCAN軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能性位點(diǎn)，結(jié)果顯示PeTua3和PeTub3序列均包含有N-糖基化位點(diǎn)、磷酸化酪蛋白激酶 II位點(diǎn)、N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)和磷酸化蛋白激酶位點(diǎn)、GTP酶域和C末端

4、結(jié)構(gòu)域，但是這些位點(diǎn)在蛋白序列中的位置、數(shù)量均存在一定的差異，這意味著它們可能存在功能上的不同。應(yīng)用MEGA4.0軟件，構(gòu)建基于tubulin蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明：PeTua3與水稻的Tua3蛋白在進(jìn)化關(guān)系上最近，Petub3與牛筋草的Tub3蛋白在進(jìn)化關(guān)系上最近，而與大部分雙子葉植物Tubulin蛋白的關(guān)系較遠(yuǎn)，這與毛竹屬于單子植物禾本科竹亞科的形態(tài)學(xué)分類相吻合。
　　3、通過構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的原核表達(dá)載

5、體pET-32b-PeTua3和pET-30a-PeTub3，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DE3，進(jìn)行基因的體外表達(dá)研究。經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，在37℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)2 h的條件下獲得高豐度的PeTua3可溶性重組蛋白；在28℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)4 h的條件下獲得高豐度的PeTub3可溶性重組蛋白。應(yīng)用His標(biāo)簽親和純化方法，獲得PeTua3、PeTub3的重組

6、蛋白，并處理擬南芥種子，幼苗表現(xiàn)為上胚軸明顯增粗，側(cè)根增多，這意味著重組蛋白可能具有加快細(xì)胞的分裂的生物學(xué)活性。
　　4、構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的正義和反義植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，通過抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥（正義和反義）和野生擬南芥在發(fā)芽和莖的生長(zhǎng)上沒有因基因的過量表達(dá)或抑制而受到影響，但對(duì)根系生長(zhǎng)影響明顯。PeTua3和 PeTub3基因的過量表達(dá)均促進(jìn)擬南芥根系生長(zhǎng)，側(cè)根增多；石蠟切

7、片顯示根系表皮薄壁細(xì)胞數(shù)量增多，且細(xì)胞體積變大，維管柱的體積增大，約是野生擬南芥的2倍，木質(zhì)部明顯加厚。而轉(zhuǎn)反義PeTua3和PeTub3基因的擬南芥根系生長(zhǎng)不正常，產(chǎn)生大量須根；石蠟切片顯示根系表皮薄壁細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞體積變小，維管柱的體積變小，木質(zhì)部明顯比較薄。
　　5、在煙草懸浮細(xì)胞（BY-2）中過量表達(dá)PeTua3和PeTub3，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)基因BY-2的G2期和 S期分裂時(shí)間明顯縮短，能顯著提高煙草細(xì)胞的有絲分

8、裂指數(shù)，細(xì)胞分裂加快。
　　細(xì)胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3的體外表達(dá)蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，具有生物學(xué)活性，這在轉(zhuǎn)PeTua3和 PeTub3基因擬南芥中進(jìn)一步得到證實(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)PeTua3和PeTub3基因煙草懸浮細(xì)胞的觀察證實(shí)，PeTua3和PeTub3基因促進(jìn)生長(zhǎng)是通過縮短細(xì)胞分裂周期實(shí)現(xiàn)的。由此證明PeTua3和PeTub3基因具有促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育的功能，這意味著PeTua3和PeTub3基因?qū)τ诜肿佑N研究具有重要