血管生成素樣蛋白3導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排參與蛋白尿形成的分子機制研究.pdf

1、探討蛋白尿發(fā)生的分子機制和尋找減少蛋白尿產(chǎn)生的“特效”治療藥物一直是人們關(guān)心的熱點問題。已有的研究顯示腎小球濾過屏障功能受損是導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生的核心事件,而做為構(gòu)成該屏障最外層的足細(xì)胞損傷則是蛋白尿形成的最關(guān)鍵因素之一。
　　足細(xì)胞足突發(fā)生融合是大多數(shù)蛋白尿疾病中最常見的病理改變之一,足細(xì)胞骨架重排引起足細(xì)胞活動力升高是導(dǎo)致足突融合發(fā)生的分子基礎(chǔ)。整合素做為介導(dǎo)細(xì)胞粘附參與細(xì)胞活動力改變的關(guān)鍵分子,有研究顯示在足細(xì)胞上除已知的整合素

2、α3β1外,還存在αVβ3亞型。其中,該亞型的β3亞基活化后,通過激活胞內(nèi)下游信號分子如Rho家族GTP酶-Cdc42和rac1,進(jìn)而引起足細(xì)胞活動力升高,細(xì)胞突觸廣泛融合。研究認(rèn)為,病理狀態(tài)下整合素β3亞基的活化是導(dǎo)致大量蛋白尿形成的關(guān)鍵因素之一。但其活化的分子機制仍不清楚。
　　血管生成素樣蛋白3(angiopoietinlike3protein,ANGPTL3)屬于血管生成素樣蛋白家族,已有的報道認(rèn)為其主要由肝細(xì)胞合成,在腎

3、臟僅有微弱表達(dá)。ANGPTL3由于具有強大的抑制脂酶活性的能力,迄今為止針對該分子的研究主要集中在脂質(zhì)代謝領(lǐng)域,有關(guān)ANGPTL3在腎臟病中的研究尚缺乏深入報道。
　　近期,我們研究小組在通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)腎病患兒腎組織高表達(dá)ANGPTL3后,進(jìn)一步證實該分子主要由腎小球的足細(xì)胞表達(dá),其表達(dá)量與足突融合及蛋白尿的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),體外實驗還發(fā)現(xiàn)ANGPTL3能夠通過結(jié)合腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素αVβ3導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性升

4、高,提示ANGPTL3可能參與了蛋白尿的發(fā)生。
　　本課題擬在明確ANGPTL3與整合素β3在足細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布和共定位關(guān)系的基礎(chǔ)上,探討足細(xì)胞分泌ANGPTL3后能否活化自身整合素B3從而導(dǎo)致骨架重排的作用特點,深入研究ANGPTL3對足細(xì)胞整合素β3亞基下游骨架調(diào)控相關(guān)信號分子的活化機制,以揭示足細(xì)胞分泌ANGPTL3后可活化自身整合素β3及其下游信號分子促發(fā)細(xì)胞骨架重排、足細(xì)胞活動力升高進(jìn)而可能參與足突融合、蛋白尿發(fā)生的新

5、機制。
　　1.腎小球足細(xì)胞特異性表達(dá)ANGPTL3
　　本次研究對人和大鼠腎小球中ANGPTL3的表達(dá)分析顯示與我們前期的報道相一致,ANGPTL3在正常腎小球中的表達(dá)量要顯著低于腎病腎小球中的表達(dá)水平,ANGPTL3與足細(xì)胞的標(biāo)記蛋白Synapotodin具有良好的共定位關(guān)系。
　　進(jìn)一步利用膠體金標(biāo)記的免疫電鏡技術(shù)分析了ANGPTL3在腎小球的精確定位和亞細(xì)胞分布特點。結(jié)果顯示,在人和大鼠的腎小球中,ANGPTL

6、3均由足細(xì)胞特異性表達(dá)。ANGPTL3在正常和腎病大鼠足細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布有所不同,即在腎病時ANGPTL3主要集中在足突部位,但在正常足細(xì)胞中主要集中在足細(xì)胞的胞體部。
　　通過westernblott和real-timePCR方法我們檢測了體外培養(yǎng)的小鼠永生化足細(xì)胞合成ANGPTL3的能力。結(jié)果證實,阿霉素(Adiamycin,ADR)及嘌呤霉素(Puramycinaminonucleoside,PAN)處理足細(xì)胞后均能導(dǎo)致足

7、細(xì)胞大量合成ANGPTL3。ELISA檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清ANGPTL3含量結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的足細(xì)胞不僅能夠合成而且能夠分泌ANGPTL3。
　　2.ANGPTL3能夠直接結(jié)合足細(xì)胞整合素β3
　　免疫熒光染色分別標(biāo)記ANGPTL3和整合素β3,激光共聚焦顯微鏡觀察可見ANGPTL3與整合素β3在體外培養(yǎng)的正常足細(xì)胞上具有良好的共定位關(guān)系,提示在足細(xì)胞ANGPTL3是整合素β3的配體之一。免疫共沉淀實驗進(jìn)一步證實,與已報道的足

8、細(xì)胞整合素β3的配體不同,ANGPTL3與整合素β3的結(jié)合方式是直接結(jié)合。
　　3.ANGPTL3是調(diào)控整合素β3活化的關(guān)鍵配體
　　整合素β3的活化做為導(dǎo)致足細(xì)胞活動力升高、蛋白尿發(fā)生的關(guān)鍵性事件,我們在本次研究中重點探討了ANGPTL3對足細(xì)胞整合素β3表達(dá)及活化水平的調(diào)控情況。結(jié)果顯示,miRNA基因敲低足細(xì)胞ANGPTL3表達(dá)后,整合素β3表達(dá)量也發(fā)生下調(diào)(P＜0.01);反之,對足細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染ANGPTL3-cDN

9、A后,足細(xì)胞在高表達(dá)ANPGTL3的同時整合素β3表達(dá)水平也發(fā)生顯著升高(P＜0.01)。上述結(jié)果提示ANGPTL3是維持正常狀態(tài)下足細(xì)胞整合素β3表達(dá)量的重要配體之一。
　　AP5做為檢測活化狀態(tài)的整合素β3的特異性單克隆抗體,本次研究我們通過免疫熒光雙標(biāo)的方法分析了病理狀態(tài)下AP5與ANGPTL3表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示,與文獻(xiàn)報道的LPS處理后的結(jié)果相似,阿霉素處理足細(xì)胞后能夠?qū)е伦慵?xì)胞整合素β3活化水平的顯著升高(P＜0.01

10、)。但是,當(dāng)基因敲低足細(xì)胞ANGPTL3后,再接受阿霉素刺激并不能夠誘整合素β3的活化水平升高,我們的這一發(fā)現(xiàn)證實,ANGPTL3不僅能夠結(jié)合整合素β3同時是病理狀態(tài)下導(dǎo)致該受體活化的關(guān)鍵配體。
　　4.ANGPTL3導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞活動力升高
　　免疫熒光染色F-actin標(biāo)記足細(xì)胞骨架形態(tài),共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架形態(tài)并分析F-actin的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)足細(xì)胞基因敲低ANGPTL3表達(dá)后,細(xì)胞骨架與陰性

11、對照細(xì)胞相比并未發(fā)生細(xì)胞骨架排列紊亂、F-actin熒光強度顯著減弱等細(xì)胞骨架重排的表現(xiàn),提示ANGPTL3對維持生理狀態(tài)下細(xì)胞骨架穩(wěn)定性并非必備條件。
　　進(jìn)一步對病理狀態(tài)下ANGPTL3對足細(xì)胞骨架重排的研究發(fā)現(xiàn),低表達(dá)ANGPTL3的足細(xì)胞在接受阿霉素刺激后顯著緩解阿霉素引起的細(xì)胞骨架重排現(xiàn)象。Westernblott分析還發(fā)現(xiàn),ANGPTL3對病理狀態(tài)下足細(xì)胞骨架重排的影響不僅包括調(diào)控骨架蛋白F-actin表達(dá)量和肌纖維排

12、列,也會影響骨架調(diào)控蛋白α-actinin-4的表達(dá)。我們的研究顯示ANGPTL3是導(dǎo)致病理狀態(tài)下足細(xì)胞骨架重排發(fā)生的關(guān)鍵分子之一。
　　細(xì)胞劃痕實驗和transwell細(xì)胞遷移計數(shù)對足細(xì)胞活動力活動力的分析顯示,足細(xì)胞基因敲低ANGPTL3表達(dá)后能夠明顯減輕阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞活動力升高。我們的結(jié)果提示ANGPTL3通過調(diào)控足細(xì)胞骨架重排可能參與了體內(nèi)蛋白尿的形成。
　　5.ANGPTL3通過整合素β3/FAK/P13K/R

13、hoA信號通路誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架重排
　　對足細(xì)胞瞬時基因轉(zhuǎn)染ANGPTL3-cDNA重組質(zhì)粒,使得足細(xì)胞高表達(dá)該蛋白后,F-actin免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)可見足細(xì)胞發(fā)生顯著骨架重排現(xiàn)象。進(jìn)一步采用針對整合素β3的單克隆抗體封閉足細(xì)胞該受體的活化后,我們發(fā)現(xiàn)與未封閉β3組相比,封閉組足細(xì)胞接受ANGPTL3轉(zhuǎn)染后未發(fā)生顯著的骨架重排現(xiàn)象,提示,ANGPTL3導(dǎo)致的足細(xì)胞骨架重排主要是通過整合素β3信號通路實現(xiàn)。
　　West

14、ernblott分析下游信號分子提示,足細(xì)胞高表達(dá)ANGPTL3后會引起整合素β3下游的FAK,RhoA磷酸化水平的顯著升高;進(jìn)一步使用PI3K抑制劑能夠抑制ANGPTL3引起的FAK,RhoA磷酸化水平升高。我們的結(jié)果顯示,整合素β3/FAK/PI3K/RhoA信號通路是ANGPTL3誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架重排發(fā)生的主要信號通路之一。
　　綜上所述,通過本課題的研究,我們首次發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞能夠特異性表達(dá)ANGPTL3。并且證實,在體外,AN

15、GPTL3是調(diào)控足細(xì)胞整合素β3表達(dá)活化的關(guān)鍵配體。ANGPTL3活化足細(xì)胞自身整合素β3后,進(jìn)而引起下游FAK、PI3K、RhoA信號通路活化,觸發(fā)細(xì)胞骨架重排發(fā)生,導(dǎo)致了足細(xì)胞活動力升高。進(jìn)一步提示ANGPTL3可能在體內(nèi)參與了病理狀態(tài)下足細(xì)胞足突融的合形成及蛋白尿的發(fā)生。
　　我們對足細(xì)胞合成ANGPTL3后誘導(dǎo)足細(xì)胞自身整合素β3信號通路活化的研究結(jié)果,將有利于拓展人們對病理狀態(tài)下足細(xì)胞自身分泌細(xì)胞因子主動參與腎小球濾過屏