紅脂大小蠹嗅覺(jué)相關(guān)基因表達(dá)譜及其OBPs功能研究.pdf

1、作為地球上種類和數(shù)量最為龐大的動(dòng)物類群之一，昆蟲(chóng)在其漫長(zhǎng)的自然選擇過(guò)程中逐漸衍生出一套精密的嗅覺(jué)感受系統(tǒng)，正是依賴著自身嗅覺(jué)系統(tǒng)的靈敏性、專一性等特點(diǎn)，昆蟲(chóng)得以從紛繁復(fù)雜的化學(xué)氣味中，篩選并識(shí)別出與自身生命活動(dòng)相關(guān)的信息，從而完成覓食、交配、產(chǎn)卵、趨避等重要的生命活動(dòng)。因此，嗅覺(jué)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)的生存繁衍的過(guò)程中扮演著重要的角色，有關(guān)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)的研究，是揭示昆蟲(chóng)生存奧秘的必要且極其重要的環(huán)節(jié)之一。
　　紅脂大小蠹(Dendrocton

2、us valens，Red Turpentine Beetle，RTB)在分類學(xué)上屬鞘翅目小蠹科(Coleoptera: Scolytidae)，大小蠹屬(Dendroctonus)，其原產(chǎn)地為美國(guó)和加拿大等北美地區(qū)，主要蛀食松杉類針葉樹(shù)種樹(shù)干，為害松屬、黃杉屬、冷杉屬等超過(guò)35種植物的根部和干部。在我國(guó)，紅脂大小蠹的寄主主要為油松，它們通過(guò)蛀食油松樹(shù)干危害樹(shù)體的健康，其蔓延擴(kuò)散速度極為迅猛。紅脂大小蠹能夠通過(guò)自身的嗅覺(jué)感受系統(tǒng)靈敏地識(shí)

3、別來(lái)周?chē)h(huán)境中各種復(fù)雜的化學(xué)信號(hào)，從而進(jìn)行各種生命活動(dòng)，完成自身種群的繁衍和擴(kuò)散。已有研究證實(shí)，嗅覺(jué)相關(guān)的基因，如氣味結(jié)合蛋白(Odorantbinding proteins，OBPs)基因，化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)基因，氣味受體（Olfactory receptors，ORs）基因等，在紅脂大小蠹識(shí)別和篩選外界氣味物質(zhì)過(guò)程中起到了重要作用。
　　本試驗(yàn)在前期對(duì)紅脂大小蠹嗅覺(jué)基因鑒定的基

4、礎(chǔ)上，對(duì)其OBPs、CSPs兩類基因在其不同組織器官內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行分析;并進(jìn)一步對(duì)DvalOBP3和DvalOBP16兩個(gè)在紅脂大小蠹體內(nèi)高表達(dá)的基因進(jìn)行體外蛋白表達(dá)，驗(yàn)證其蛋白與紅脂大小蠹生命活動(dòng)相關(guān)的8種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。后續(xù)，又對(duì)紅脂大小蠹?xì)馕督到饷赶嚓P(guān)基因進(jìn)行了發(fā)掘和初步歸類分析，主要結(jié)果如下:
　　1.紅脂大小蠹?xì)馕督Y(jié)合蛋白(OBPs)表達(dá)譜研究
　　利用RT-qPCR對(duì)已鑒定得到的21個(gè)紅脂大小蠹OBP基因進(jìn)

5、行表達(dá)分析。結(jié)果表明，DvalOBP在紅脂大小蠹成蟲(chóng)的觸角上皆有不同程度的表達(dá)。12個(gè)DvalOBP基因(DvalOBP1-5、DvalOBP12、DvalOBP14-18、DvalOBP20）呈現(xiàn)出觸角特異（高）表達(dá)的特點(diǎn);DvalOBP13、DvalOBP19在紅脂大小蠹的足，翅中呈特異（高）表達(dá)的特點(diǎn);DvalOBP6、DvalOBP8-11、DvalOBP20在紅脂大小蠹幼蟲(chóng)期和蛹期的表達(dá)量要明顯高于成蟲(chóng)觸角、足、翅等組織的表達(dá)

6、量。
　　2.紅脂大小蠹化學(xué)感受蛋白(CSPs)表達(dá)譜研究
　　利用RT-qPCR對(duì)已鑒定得到的6個(gè)紅脂大小蠹CSP基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示:DvalCSP基因具有廣泛的表達(dá)譜，在紅脂大小蠹的不同組織，不同的生長(zhǎng)時(shí)期皆有分布。其中，DvalCSP5在紅脂大小蠹足和翅中呈現(xiàn)特異（高）表達(dá)特點(diǎn);DvalCSP2，DvalCSP5在紅脂大小蠹成蟲(chóng)的4個(gè)組織中的表達(dá)量普遍較高，蛹和幼蟲(chóng)期表達(dá)量微弱，并有雌性觸角高表達(dá)現(xiàn)象;Dval

7、CSP4，DvalCSP5，DvalCSP6在紅脂大小蠹的雌雄觸角中的表達(dá)量微弱。
　　3.紅脂大小蠹味氣味結(jié)合蛋白(OBPs)基因功能的研究
　　利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)探究DvalOBP3，DvalOBP16兩個(gè)在紅脂大小蠹觸角高表達(dá)的氣味結(jié)合蛋白與8種紅脂大小蠹生命活動(dòng)相關(guān)的氣味物質(zhì)的結(jié)合能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示:在與4種紅脂大小蠹信息素結(jié)合的過(guò)程中，DvalOBP3與桃金娘烯醛的結(jié)合能力最強(qiáng)，與順-馬鞭草烯醇和反-馬鞭草烯醇的

8、結(jié)合能力較弱，與桃金娘烯醇沒(méi)有明顯結(jié)合反應(yīng)。DvalOBP16與4種信息素有一定的結(jié)合能力，與反-馬鞭草烯醇的結(jié)合能力最強(qiáng)。DvalOBP3和DvalOBP16對(duì)4種寄主植物所產(chǎn)生的萜烯類化合物都具有一定的結(jié)合能力，且這兩種蛋白與同種寄主揮發(fā)物質(zhì)的結(jié)合能力表現(xiàn)出相似性。
　　4.紅脂大小蠹?xì)馕督到庥嘘P(guān)基因的鑒定與分析
　　對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源比對(duì)，鑒定得到49個(gè)細(xì)胞色素P450基因(cytochromeP450s，CYP45