雌激素受體-α36、假想蛋白LOC147710和網(wǎng)膜素-1調(diào)控骨代謝的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、絕經(jīng)后婦女雌激素受體-α36介導(dǎo)17β-雌二醇的骨保護(hù)作用
　　 目的：雌激素受體-alpha36(ER-α36)是一種膜受體，不同于ER-α66、ER-α46和ER-β主要介導(dǎo)雌激素的核效應(yīng)，ER-α36只能介導(dǎo)雌激素的膜效應(yīng)，如促分裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)信號(hào)通路的激活。本研究旨在探討ER-α36是否與ER-α66一樣，也參與調(diào)控骨代謝。
　　 方法：免疫組織化學(xué)染色觀察骨組

2、織切片中ER-α36的表達(dá)。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖。ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡。磷酸對(duì)硝基苯酚法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性。放射免疫分析法(RIA)測(cè)定骨鈣素(OCN)含量。茜素紅S染色評(píng)估成骨細(xì)胞基質(zhì)的礦化程度。Western blot檢測(cè)：ER-α36、ER-α66、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。H2DCFDA熒光探針檢測(cè)活性氧簇(ROS)水平。ER-α36 shRNA和真核表達(dá)載體調(diào)控成骨

3、細(xì)胞和破骨細(xì)胞ER-α36表達(dá)，并采用ERK和ROS抑制劑觀察E2調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞增殖、分化或凋亡的ER-α36受體及受體后信號(hào)途徑。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QRT-PCR)檢測(cè)骨組織OCN和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)基因表達(dá)量。將154例椎間盤突出、椎管狹窄或脊椎前移進(jìn)行開窗術(shù)的患者分為絕經(jīng)前組(60例)和絕經(jīng)后組(94例，其中包括骨質(zhì)疏松組30例，低骨量組31例，正常骨量組33例)，用雙能量X線吸收法(DXA)測(cè)定患者骨密度(

4、BMD)，取血后用ELISA檢測(cè)血清骨形成標(biāo)志物OCN和骨吸收標(biāo)志物Ⅰ型膠原氨基末端肽(NTX)水平，收集脊椎松質(zhì)骨標(biāo)本并用QRT-PCR檢測(cè)ER-α36、ER-α66、ER-α46和ER-β的表達(dá)水平。行動(dòng)物試驗(yàn)，觀察ER-α36選擇性調(diào)節(jié)劑ICl62對(duì)去卵巢大鼠骨代謝的影響。
　　 結(jié)果：(1)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果：ER-α36介導(dǎo)絕經(jīng)后低水平(10pM)E2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞ERK短暫激活，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制其分化和凋亡，而

5、ER-α36介導(dǎo)10pM E2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞ERK持續(xù)激活(依賴于ROS)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡；但10pM E2對(duì)ER-α36陰性成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡無作用。(2)骨組織培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果：在高表達(dá)ER-α36的骨組織，10pM E2顯著抑制骨形成細(xì)胞因子OCN和骨吸收細(xì)胞因子TRAP的表達(dá)；而在低表達(dá)ER-α36的骨組織，10pM E2對(duì)OCN和 TRAP的表達(dá)無影響。(3)方差分析顯示：絕經(jīng)前組骨ER-α36表達(dá)水平顯著低

6、于絕經(jīng)后各組；絕經(jīng)后正常骨量組ER-α36表達(dá)水平較低骨量組和骨質(zhì)疏松組高，低骨量組ER-α36表達(dá)水平較骨質(zhì)疏松組高；絕經(jīng)后各組骨ER-α66、ER-α46和ER-β表達(dá)水平均低于絕經(jīng)前組，絕經(jīng)后各組間ER-α66、ER-α46和ER-β表達(dá)水平差異無顯著性。(4)相關(guān)分析顯示：絕經(jīng)后婦女骨ER-α36表達(dá)水平與BMD呈正相關(guān)，與血清OCN和NTX水平呈負(fù)相關(guān)；絕經(jīng)前婦女骨ER-α36表達(dá)水平與BMD、OCN和NTX水平無相關(guān)性；絕經(jīng)

7、前和絕經(jīng)后婦女骨ER-α66、ER-α46和ER-β表達(dá)水平與BMD、OCN和NTX水平均無相關(guān)性。(5)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果：IC162干預(yù)去卵巢大鼠可增加BMD，但對(duì)體重和子宮重量無影響。
　　 結(jié)論：ER-α36在絕經(jīng)后婦女骨代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，高表達(dá)ER-α36的成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞對(duì)E2高度敏感，ER-α36介導(dǎo)絕經(jīng)后低水平E2的骨保護(hù)作用。ER-α36的選擇性調(diào)節(jié)劑IC162在去卵巢大鼠發(fā)揮骨保護(hù)作用，但對(duì)子宮無影響。

8、
　　 第二部分、假想蛋白LOC147710突變與常染色體隱性骨質(zhì)硬化癥的發(fā)病相關(guān)
　　 目的：骨質(zhì)硬化癥是由于破骨細(xì)胞生成障礙或功能缺陷導(dǎo)致的一組以全身骨密度增高為主要特征的骨代謝疾病群，具有高度遺傳異質(zhì)性。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有11種基因的功能丟失性突變與人類骨質(zhì)硬化癥有關(guān)，其特點(diǎn)是單基因突變引起發(fā)病，且無重疊。本課題對(duì)一個(gè)常染色體隱性遺傳的骨質(zhì)硬化癥家系(家系總成員11人，其中5名成員的基因型為純合子患病基因型)進(jìn)行了

9、研究，以確定該家族性骨質(zhì)硬化癥的致病基因。
　　 方法：雙能X線吸收法(DXA)測(cè)定骨密度(BMD)。提取11名家系成員及180名正常對(duì)照者外周血DNA，用基因測(cè)序排除已知與骨質(zhì)硬化癥相關(guān)的11個(gè)基因的突變后，進(jìn)行全基因組掃描、精細(xì)基因定位及單倍型分析確定致病基因的候選區(qū)，然后對(duì)該區(qū)基因外顯子進(jìn)行測(cè)序以確定該致病基因突變。Northern blot和Western blot檢測(cè)LOC147710在人體各組織的表達(dá)量以及在破骨前體

10、細(xì)胞CD14+外周血單核細(xì)胞(PBMCs)向破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式。Westernblot檢測(cè)LOC147710蛋白的亞細(xì)胞定位。TRAP染色和甲苯胺藍(lán)染色分別觀察破骨細(xì)胞的形成和骨吸收活性。構(gòu)建LOC147710真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染LOC147710-/-PBMCs，觀察轉(zhuǎn)染后是否能恢復(fù)其向破骨細(xì)胞分化的能力。
　　 結(jié)果：全基因組掃描、精細(xì)基因定位及單倍型分析結(jié)果顯示，染色體19q13.2-q13.3的D19S197至D

11、19S545之間的8.36cM范圍為致病基因候選區(qū)，連鎖分析得最大LOD值Zmax=2.907(θ=0時(shí))。基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在LOC147710基因的2號(hào)外顯子上存在一個(gè)純合子無義突變(c.295C>T)。該無義突變使得終止密碼子提前出現(xiàn)(p.R99X)，導(dǎo)致其表達(dá)一種缺失93個(gè)氨基酸殘基的截短蛋白。LOC147710基因表達(dá)于人類骨組織和小腸組織，而不表達(dá)于其它人類組織，提示該基因產(chǎn)物是一種與骨礦物質(zhì)吸收和代謝密切相關(guān)的高特異性調(diào)節(jié)因子

12、。本研究顯示，LOC147710表達(dá)于原代人破骨細(xì)胞，而在原代人成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞PBMCs則不表達(dá)。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)PBMCs向破骨細(xì)胞分化的過程中，LOC147710的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。LOC147710蛋白定位于破骨細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中，而在胞核中不表達(dá)。LOC147710-/-PBMCs向破骨細(xì)胞分化的能力極其微弱，而重新導(dǎo)入LOC147710基因后，可使其向破骨細(xì)

13、胞分化的能力恢復(fù)至正常水平。
　　 結(jié)論：LOC147710基因純合子無義突變(c.295C>T)引起該基因的功能丟失，抑制破骨細(xì)胞分化能力，從而導(dǎo)致了一種特殊類型的常染色體隱性骨質(zhì)硬化癥，此型尚未報(bào)道。
　　 第三部分、網(wǎng)膜素-1在去卯巢小鼠和護(hù)骨素基因敲除小鼠發(fā)揮骨保護(hù)作用
　　 目的：網(wǎng)膜素-1(Omentin-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種主要由網(wǎng)膜脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，其在血漿中含量豐富，達(dá)到ng/ml水平。

14、本研究旨在探討Omentin-1在體外和體內(nèi)對(duì)骨代謝的影響。
　　 方法：測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(OCN)和基質(zhì)礦化以判斷成骨細(xì)胞的分化程度。ELISA檢測(cè)成骨細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體(RANKL)和護(hù)骨素(OPG)蛋白分泌水平。在體外成骨細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，觀察重組Omentin-1蛋白對(duì)破骨細(xì)胞生成與分化的影響。注射Omentin-1腺病毒表達(dá)載體到去卵巢(OVX)小鼠和OPG基因敲除(OPG

15、-/-)小鼠體內(nèi)，觀察Omentin-1對(duì)這兩種動(dòng)物模型骨密度(BMD)、骨強(qiáng)度和骨代謝轉(zhuǎn)換的影響。
　　 結(jié)果：(1)Omentin-1直接抑制成骨細(xì)胞的分化，但并不直接抑制破骨細(xì)胞分化。在成骨細(xì)胞/破骨前體細(xì)胞體系中，Omentin-1刺激成骨細(xì)胞生成OPG，抑制成骨細(xì)胞合成RANKL，從而間接地抑制了破骨細(xì)胞的生成。(2)Omentin-1可以部分恢復(fù)OVX小鼠的BMD和骨強(qiáng)度，下調(diào)OVX小鼠血清骨形成標(biāo)志物OCN和骨吸收