三個(gè)CTV弱毒分離株的拮抗效果研究.pdf

1、由柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是世界范圍內(nèi)最具經(jīng)濟(jì)重要性的柑橘病害。應(yīng)用弱毒系交叉保護(hù)(MSCP)是防治莖陷點(diǎn)型柑橘衰退病的有效方法之一。因此，研究CTV弱毒分離株對(duì)我國(guó)強(qiáng)毒株系的拮抗作用并對(duì)其效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，是篩選具有MSCP應(yīng)用價(jià)值的CTV弱毒分離株的重要環(huán)節(jié)。本文通過(guò)CTV弱毒分離株對(duì)強(qiáng)毒分離株的拮抗試驗(yàn)，篩選出拮抗作用強(qiáng)的弱毒株系，可為我國(guó)應(yīng)用MSCP防治柑橘衰退病的打下一定的基礎(chǔ)。 本文首先對(duì)中國(guó)農(nóng)科院柑橘研究所國(guó)家柑橘

2、苗木脫毒中心收集的CTV弱毒分離株CT10、CT12、CT17和強(qiáng)毒分離株CT4的p20、p23、p25三個(gè)基因RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行HinfⅠ/RFLP分析，其次對(duì)這三個(gè)基因測(cè)序后進(jìn)行了酶切位點(diǎn)分析和同源性分析，同時(shí)應(yīng)用四對(duì)引物對(duì)供試毒源基因組5’基因片段進(jìn)行RT-PCR分析，以達(dá)到區(qū)分強(qiáng)、弱毒分離株系的目的。應(yīng)用上述方法結(jié)合莖陷點(diǎn)癥狀分析，對(duì)3個(gè)CTV弱毒分離株與強(qiáng)毒分離株CT4之間的拮抗效果進(jìn)行了評(píng)估。此外，還比較了9個(gè)保存在新會(huì)橙

3、上的CTV分離株嫁接接種到鳳凰柚前后p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP變化情況。研究結(jié)果如下： 1)通過(guò)酶切發(fā)現(xiàn)CTV強(qiáng)毒分離株CT4是以p25HinfⅠRFLP第Ⅲ組群為主的p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ、第Ⅲ組群的混合株系，弱毒分離株CT17與弱毒分離株CT12均屬p25/HinfⅠRFLP第Ⅰ組群，弱毒分離株CT10屬p25/HinfⅠRFLP第Ⅳ組群。對(duì)p20基因的HinfⅠRFLP分析表明，CT10不能被酶切；C

4、T12、CT17的p20/HinfⅠRFLP譜帶相同，均有約180bp、約370bp的DNA條帶；CT4的酶切譜帶具有約100bp、約180bp、約280bp、約370bp的4條DNA條帶。 2)對(duì)供試的4個(gè)CTV分離株的p20、p23和p25基因序列同源性分析表明在CT10、CT12和CT17三個(gè)弱毒分離株中CT17與強(qiáng)毒分離株CT4同源性最高。 3)RT-PCR分析表明用引物T305’(f，r)和引物T30K17(f

5、,r)進(jìn)行RT-PCR均可將CTV強(qiáng)毒分離株CT4與弱毒分離株CT17、CT12區(qū)分開。 4)通過(guò)本試驗(yàn)所建立的鑒別CTV強(qiáng)、弱毒株系的RFLP方法和其與RT-PCR相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CT4強(qiáng)毒分離株的定期分子監(jiān)控。 5)拮抗實(shí)驗(yàn)中對(duì)CTV強(qiáng)毒分離株CT4的分子監(jiān)控表明，接種強(qiáng)毒分離株后1個(gè)月、3個(gè)月、5個(gè)月和8個(gè)月，CTV強(qiáng)毒分離株CT4的檢出率在經(jīng)弱毒分離株CT10接種的植株分別為25％、50％、87.5％和10

6、0％；在經(jīng)CT12接種的植株分別為40％、50％、80％和80％；在經(jīng)CT17接種的植株分別為9.1％、27.3％、35.4％和45.6％。三個(gè)CTV弱毒分離株均減少或延遲了強(qiáng)毒分離株CT4的檢出，對(duì)CT4均表現(xiàn)一定拮抗作用，其中CT17的拮抗效果最好。莖陷點(diǎn)癥狀的分析結(jié)果與分子檢測(cè)結(jié)果一致。 6)9個(gè)保存在新會(huì)橙上的CTV分離株嫁接接種到鳳凰柚的p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP變化情況的比較試驗(yàn)，結(jié)果表明有7個(gè)分離株R