甘遂醋炙降毒的機理及抗癌活性部位篩選的初步研究.pdf

1、甘遂具有瀉下、抗病毒、抗癌、抗白血病、抗過敏等多種藥理作用，但其毒性和刺激性極大的限制了其臨床應用。本試驗旨在探討甘遂醋炙降毒的機理，并初步篩選甘遂的抑癌活性部位。
　　 方法:本實驗以甘遂、兩種醋炙及其不同極性萃取物為試驗樣品，采用不同方法進行了研究。
　　 采用了文火(A)和武火(B)兩種醋炙方法，制得醋炙甘遂A和醋炙甘遂B。并采用改良蔻氏法，以小鼠為實驗動物開展了急性毒性試驗分別測定了甘遂生品及兩種醋炙甘遂的LD5

2、0。并考察了甘遂及醋炙甘遂對小鼠的皮膚刺激性。對數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計學分析。
　　 分別以甘遂生品及兩種醋炙品的LD50的1/30、1/50、1/70設計高、中、低給藥劑量，對小鼠給藥一周，采血測定肝腎相關的生化指標，并取肝腎切片做HE染色。采用代謝籠收集了小鼠尿液，觀察了甘遂生品及兩種醋炙品不同給藥劑量對小鼠利尿作用的影響。
　　 分別以甘遂生品及兩種醋炙品的LD50的1/10、1/20、1/30設計高、中、低給藥劑量，對各

3、組小鼠灌胃一周，每天一次，繪制小鼠生存曲線，并進行生存曲線的統(tǒng)計學分析，比較兩種醋炙方法對甘遂毒性的差異。
　　 采用MTT法觀察了甘遂生品、醋炙品醇提物及其不同極性溶劑萃取物對體外培養(yǎng)腫瘤細胞增殖的影響。以甘遂、醋炙甘遂醇提物及其不同極性溶劑環(huán)己烷、乙酸乙酯的萃取物和水溶性組分為試驗樣品，配制成不同的濃度梯度為供試液，分別與體外培養(yǎng)的MCF-7、A549細胞、HepG2細胞作用48h后，觀察各供試液對細胞增殖的影響。
　

4、　 采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測器(RP-HPLC-PAD)和高分辨電噴霧飛行時間質譜(ESI-TOF-MS)聯(lián)用技術分析甘遂醋炙前后化學成分的變化，初步鑒定出醋炙前后部分變化顯著的化學成分。
　　 結果：甘遂、醋炙甘遂A和醋炙甘遂B的半數(shù)致死量分別為：20±6mg/g；92±10mg/g；105±11mg/g。急性毒性試驗和刺激性試驗均表明：炮制可顯著降低甘遂的毒性，兩種炮制方法對甘遂的毒性有顯著性差別。甘遂經(jīng)醋炙后

5、，從對小鼠的半數(shù)致死量可看出其毒性顯著下降，對皮膚的刺激性顯著降低，且兩種醋炙甘遂半數(shù)致死量也有統(tǒng)計學差別(P＜0.05)。醋炙后甘遂對小鼠的肝腎毒性顯著減小，且武火醋炙甘遂較文火醋炙對小鼠的肝腎毒性更小。甘遂低劑量及醋炙品的中低劑量表現(xiàn)出一定的利尿作用，而醋炙品利尿作用均強于生品。生存曲線分析也表明醋炙甘遂B對小鼠的毒性更小。以上實驗結果均表明：醋炙可顯著降低甘遂的毒性，而武火所得醋炙甘遂B毒性更小，而仍然保持利尿作用。
　　

6、 MTT試驗表明：甘遂醇提取對MCF-7有較好的抑制作用，IC50值為202μg/mL，而對A549細胞、HepG2細胞無抑制作用。甘遂乙酸乙酯萃取物和環(huán)己烷萃取物對MCF-7有較好的抑制作用，IC50值分別為552μg/mL、378μg/mL，對A549細胞、HepG2細胞僅在高濃度有抑制增殖的作用。甘遂水溶性組分對MCF-7細胞無抑制增殖的作用，而對A549細胞、HepG2細胞低濃度無抑制作用，高濃度有促進增殖的作用。醋炙甘遂的乙酸

7、乙酯部位仍有較好的抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細胞增殖的作用，而水溶物即無促進細胞增殖也無抑制增殖的作用。
　　 采用了HPLC-MS聯(lián)用技術分析甘遂醋炙前后化學成分的變化，根據(jù)質譜行為及文獻參考，定性了21種化學成分，其中有19個為生品和醋炙品均有的成分；醋炙后有2種化學成分有所增加，而有14個成分顯著減少，且醋炙甘遂B較醋炙甘遂A降低幅度更大。其中有1個成分經(jīng)醋炙后消失；而有4種成分為醋炙甘遂B中消失的。新增化學成分1個，且峰面積醋炙

8、甘遂B較A大。
　　 結論：通過急性毒性試驗、肝腎毒性及利尿作用考察、生存曲線分析，可認為醋炙甘遂B毒性較小，用藥更安全。武火醋炙較文火醋炙甘遂的炮制方法好，即將醋浸潤的甘遂在280℃以10分鐘炒干為佳。由此可見，醋炙火候對甘遂的毒性存在一定影響。因此對甘遂醋炙工藝中明確甘遂醋炙火候的規(guī)定是十分必要的。該部分的實驗結果為醋炙甘遂工藝中火候把握及臨床安全用藥提供新的理論依據(jù)，進一步解釋甘遂炮制降毒的機理奠定了基礎，
　　

9、MTT試驗研究表明：甘遂及醋炙甘遂的乙酸乙酯部位均表現(xiàn)出一定的細胞毒作用，而水溶性組分存在一定的促進細胞增殖的作用。醋炙后的水溶物無促進細胞增殖的作用，提示，甘遂抑瘤成分可能為存在于乙酸乙酯，促生瘤成分可能存在水溶性組分中。該部分的研究表明乙酸乙酯部位可能為甘遂的抗癌活性部位，為甘遂抗癌活性部位的研究提供了初步的篩選依據(jù)，也從細胞水平為甘遂醋炙降毒提供新的理論參考。
　　 HPLC-MS聯(lián)用技術分析甘遂醋炙前后化學成分的變化，初

10、步定性了21種化學成分。從總體上看，甘遂醋炙前后化學成分的變化，主要體現(xiàn)在大多數(shù)成分的含量顯著降低上，完全消失和新增加的成分不多?？梢姶字私刀镜臋C理主要在于降低其中有些物質的含量，醋炙甘遂B較A降低幅度更大，這也從物質基礎的層面揭示了醋炙甘遂B比A毒性小、醋炙降毒的機理。由于炮制前后甘遂的質譜行為存在明顯的差異，可采用類似中藥指紋圖譜的方法將甘遂炮制前后的質譜總離子流圖標準化，為其制定定性或半定量的質控標準，用科學的方法來判別炮制程度的