Catheps in V作為保護(hù)組織損傷-抗炎新型靶點(diǎn)的前期機(jī)制.pdf

1、背景:胞外的雙硫鍵HMGB1(高遷移率族蛋白B1)是一種關(guān)鍵的損傷相關(guān)模式分子DAMP，在眾多急慢性疾病中，通過(guò)細(xì)胞表面Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)病理性炎癥:HMGB1-TLR4信號(hào)通路的特異性抑制劑可以選擇性阻斷內(nèi)源性炎癥激活的早期事件，為相關(guān)炎癥性疾病提供新的治療藥物。基于HMGB1-TLR4-TNF-α信號(hào)軸的細(xì)胞高通量篩選發(fā)現(xiàn)，第一代HIV蛋白酶抑制劑Saquinavir(SQV)可有效阻斷HMGB1-TLR4激活后的炎癥

2、因子（TNF-α和IL-6）釋放。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SQV預(yù)處理能顯著減輕肝臟熱缺血再灌注模型（Liver Ischemia/Reperfusion Injury,IR）的肝損傷，而HMGB1-TLR4信號(hào)通路正是Liver IR模型的核心通路之一，同時(shí)鑒定到半胱氨酸蛋白酶V(Cathepsin V CTSV)是SQV的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)之一。而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體外重組蛋白實(shí)驗(yàn)均證實(shí)CTSV與TLR4存在相互作用且可被SQV阻斷，CTSV低表達(dá)致使H

3、MGB1-TLR4激活受限，揭示CTSV在TLR4信號(hào)通路中的未知作用，提示SQV通過(guò)靶向CTSV而干預(yù)HMGB1-TLR4信號(hào)軸及其介導(dǎo)疾病。
　　目的:本研究中，我們擬深入探究CTSV與TLR4相互作用的實(shí)質(zhì)及其在TLR4信號(hào)通路中的作用機(jī)制，同時(shí)全面評(píng)估SQV抑制HMGB1-TLR4信號(hào)通路和保護(hù)動(dòng)物炎癥模型的具體機(jī)制，為開(kāi)發(fā)CTSV為新型抗炎靶點(diǎn)和擴(kuò)大SQV適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。。
　　方法:以SQV和另一種已知的CT

4、SV抑制劑SID26681509(SID)為靶向CTSV的藥物探針，分別評(píng)估SQV/SID對(duì)TLR4信號(hào)通路受體水平的早期事件（配體-受體結(jié)合、受體二聚化、TLR4-MyD88和TLR4-TRIF活化）以及下游公共通路即NF-κB水平的影響，以期在TLR4信號(hào)通路中定位CTSV。同時(shí)分別評(píng)估CTSV低表達(dá)和SQV/SID抑制CTSV對(duì)其它模式識(shí)別受體(TLR1/2、TLR3、IL-1R)介導(dǎo)信號(hào)通路的影響，與前一部分內(nèi)容相互佐證。運(yùn)用點(diǎn)

5、突變結(jié)構(gòu)域變異體的方法探究CTSV與TLR4相互作用所涉及的結(jié)構(gòu)域，決定CTSV蛋白酶活性是否參與TLR4信號(hào)通路，明確SQV抑制CTSV的具體機(jī)制。同時(shí)觀察SQV預(yù)處理對(duì)SQV保護(hù)肝臟缺血再灌注模型的必要性，以評(píng)估CTSV抑制劑用于臨床情況的可行性。
　　結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)SQV在受體水平特異性抑制TLR4介導(dǎo)的MyD88-IRAK4/1活化和TRIF-IRF3的活化，而在NF-κB水平非特異性地抑制TLR1/2、3、4和IL-1R

6、以及TNFR引起的NF-κB活化或TNF-α釋放。SID作為特異性CTSV抑制劑同樣具有上述特性。而CTSV低表達(dá)可造成MyD88依賴性的TLR1/2、TLR4下游TNF-α生成減少，但對(duì)TRIF依賴性的TLR3通路無(wú)影響。在相同濃度時(shí)SQV抑制TLR4-MyD88-IRAK1激活的程度強(qiáng)于SID，與兩者在阻斷CTSV-TLR4相互作用的強(qiáng)弱趨勢(shì)一致，與兩者在抑制CTSV蛋白酶活性的強(qiáng)弱趨勢(shì)相反。同時(shí)，酶活性減低的CTSV變異體（酶結(jié)構(gòu)

7、域變異體C138S，N端糖基化變異體N292Q）依舊可與TLR4相互作用。此外，僅在灌注期給予SQV依舊可以保護(hù)HMGB1-TLR4介導(dǎo)的肝臟缺血再灌注損傷。
　　結(jié)論:本研究進(jìn)一步確定Cathepsin V是FDA認(rèn)證藥物HIV蛋白酶抑制劑SQV特異性拮抗HMGB1-TLR4介導(dǎo)炎癥的新型靶點(diǎn)，并揭示CTSV參與TLR4受體水平對(duì)MyD88的募集，而SQV的作用方式很可能是直接阻斷CTSV與TLR4的相互作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了SQV和